Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Лекция 5.

БИОТЕХНОЛОГИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ.

КЛЕТОЧНАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В ЖИВОТНОВОДСТВЕ.

Трансплантация эмбрионов

Разработка метода искусственного осеменения сельскохозяйствен­ных животных и его практическое применение обеспечили большой ус­пех в области улучшения генетики животных. Использование этого мето­да в сочетании с длительным хранением семени в замороженном состоя­нии открыло возможность получения десятков тысяч потомков от одного

производителя в год. Этот прием, по существу, решает проблему рацио­нального использования производителей в практике животноводства.

Что касается самок, то традиционные методы разведения животных позволяют получать от них лишь несколько потомков за всю жизнь. Низ­кий уровень воспроизводства у самок и длительный интервал времени между поколениями (6—7 лет у крупного рогатого скота) ограничивают генетический процесс в животноводстве. Решение этой проблемы ученые видят в применении метода трансплантации эмбрионов. Суть метода со­стоит в том, что генетически выдающиеся самки освобождаются от необ­ходимости вынашивания плода и вскармливания потомства. Кроме того, их стимулируют с целью увеличения выхода яйцеклеток, которые затем извлекают на стадии ранних зародышей и пересаживают менее ценным в генетическом отношении реципиентам.

Технология трансплантации эмбрионов включает такие основные звенья, как вызывание суперовуляции, искусственное осеменение доно­ра, извлечение эмбрионов (хирургическое или нехирургическое), оценка их качества, кратковременное или длительное хранение и пересадка.

Стимуляция суперовуляции.Самки млекопитающих рождаются с большим (несколько десятков и даже сотен тысяч) числом половых кле­ток. Большинство из них постепенно погибают в результате атрезии фол­ликулов. Только небольшое число примордиальных фолликулов перехо­дят в антральные в процессе роста. Однако практически все растущие фолликулы реагируют на гонадотропную стимуляцию, которая приводит их к конечному созреванию. Обработка самок гонадотропинами в фолли­кулярной фазе полового цикла или в лютеиновой фазе цикла в сочетании с индуцированием регрессии желтого тела простагландином Ф₂ (ПГФ₂) или его аналогами приводит к множественной овуляции или так называе­мой суперовуляции.

Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у са­мок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови же­ребой кобылы (СЖК), начиная с 9—14-го дня полового цикла. Через 2—3 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф_2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.

В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных жи­вотных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения. Перво­начально рекомендовалось многократное осеменение коров с использо­ванием нескольких доз спермы. Обычно вводят 50 млн. живых спермато­зоидов в начале охоты и через 12—20 ч осеменение повторяют.

Извлечение эмбрионов.Эмбрионы крупного рогатого скота посту­пают из яйцевода в матку между 4-м и 5-м днем после начала охоты (меж­ду 3-м и 4-м днем после овуляции),

В связи с тем, что нехирургическое извлечение возможно только из рогов матки, то эмбрионы извлекают не ранее 5-го дня после начала охоты.

Несмотря на то что при хирургическом извлечении эмбрионов у круп­ного рогатого скота достигнуты отличные результаты, этот метод неэф­фективен — относительно дорогостоящий, неудобный для применения в условиях производства.

Нехирургическое извлечение эмбрионов состоит в использовании катетора.

Наиболее оптимальные сроки для извлечения эмбрионов — 6—8-й день после начала охоты, так как ранние бластоцисты этого возраста наи­более пригодны для глубокого замораживания и могут быть с высокой эффективностью пересажены нехирургическим способом. Корову-донора используют 6—8 раз в год, извлекая по 3—6 эмбрионов.

У овец и свиней нехирургическое извлечение эмбрионов невозможно
ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки. Одна­
ко хирургическая операция у этих видов животных относительно проста
и непродолжительна.

Пересадка эмбрионов. Параллельно с разработкой хирургического метода извлечения эмбрионов у крупного рогатого скота значительный прогресс был достигнут и в нехирургической пересадке эмбрионов (рис. 5.2). В пайету набирают свежую питательную среду (столбик длиной 1,0—1,3 см), затем небольшой пузырек воздуха (0,5 см) и далее основной объем среды с эмбрионом (2—3 см). После этого засасывают немного воздуха (0,5 см) и питательную среду (1,0—1,5 см). Пайету с эмбрионом помещают в катетер Кассу и до момента пересадки хранят в термостате при 37°С. Нажатием на шток катетера выдавливают содержимое пайеты вме­сте с эмбрионом в рог матки.

Хранение эмбрионов. Применение метода трансплантации эмбрио­нов потребовало разработки эффективных методов их хранения в период между извлечением и пересадкой. В производственных условиях эмбрио­ны обычно извлекают утром, а пересаживают в конце дня. Для хранения эмбрионов в течение этого времени используют фосфатный буфер с неко­торыми модификациями при добавлении эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и при комнатной температуре или температуре 37°С.

Наблюдения показывают, что эмбрионы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 24 ч без заметного снижения их после­дующей приживляемости.

Пересадка эмбрионов свиней, культивируемых 24 ч, сопровождается нормальной приживляемостью.

Выживаемость эмбрионов в определенной степени может быть уве­личена охлаждением их ниже температуры тела. Чувствительность эм­брионов к охлаждению зависит от вида животного.

Эмбрионы свиней особенно чувствительны к охлаждению. Пока не удалось сохранить жизнеспособность эмбрионов свиней на ранних ста­диях развития после охлаждения их ниже 10—15°С (С. Полдж, 1982).

Эмбрионы крупного рогатого скота на ранних стадиях развития так­же очень чувствительны к охлаждению до 0°С.

Эксперименты последних лет позволили определить оптимальные соотношения между скоростью охлаждения и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено, что если эмбрионы охлаждают медленно (1°С/мин) до очень низкой температуры (ниже— 50°С) с после­дующим переносом в жидкий азот, то они требуют и медленного оттаива­ния (25°С/мин или медленнее). Быстрое оттаивание таких эмбрионов мо­жет вызвать осмотическую регидратацию и разрушение. Если эмбрионы замораживают медленно (1°С/мин) только до - 25 и 40°С с последующим переносом в жидкий азот, то их можно оттаивать очень быстро (300°С/мин). В этом случае остаточная вода при переносе в жидкий азот трансформируется в стекловидное состояние (С. Вилладсен, 1980).

Выявление этих факторов привело к упрощению процедуры замора­живания и оттаивания эмбрионов крупного рогатого скота. В частности, оттаивают эмбрионы, как и сперму, в теплой воде при 35°С в течение 20 с непосредственно перед пересадкой без применения специального обору­дования с заданной скоростью повышения температуры.

Оплодотворение яйцеклеток вне организма животного

Разработка системы оплодотворения и обеспечения ранних стадий развития эмбрионов млекопитающих вне организма животного (in vitro) имеет огромное значение в решении ряда научных задач и практических вопросов, направленных на повышение эффективности разведения жи­вотных.

Для этих целей необхо­димы эмбрионы на ранних стадиях развития, которые можно извлечь только хирургическими методами из яйцеводов, что является трудоем­ким и не дает достаточного числа зародышей для проведения этой рабо­ты.

Оплодотворение яйцеклеток млекопитающих in vitro включает сле­дующие основные этапы: созревание ооцитов, капацитацию спермато­зоидов, оплодотворение и обеспечение ранних стадий развития.

Созревание ооцитов in vitro.Большое число половых клеток в яич­никах млекопитающих, в частности у крупного рогатого скота, овец и свиней с высоким генетическим потенциалом, представляет источник ог­ромного потенциала воспроизводительной способности этих животных в ускорении генетического прогресса по сравнению с использованием воз­можностей нормальной овуляции. У этих видов животных, как и других млекопитающих, число ооцитов, овулирующих спонтанно во время охо­ты, составляет только незначительную часть от тысяч ооцитов, находя­щихся в яичнике при рождении животного. Остальные ооциты регенери­руют внутри яичника или, как говорят обычно, подвергаются атрезии. Естественно возникал вопрос, нельзя ли выделить ооциты из яичников путем соответствующей обработки и провести их дальнейшее оплодотво­рение вне организма животного. В настоящее время не разработаны мето­ды использования всего запаса ооцитов в яичниках животных, но значи­тельное число ооцитов может быть получено из полостных фолликулов для дальнейшего их созревания и оплодотворения вне организма.

В настоящее время применение на практике нашло созревание in vitro только ооцитов крупного рогатого скота. Ооциты получают из яичников коров после убоя животных и путем прижизненного извлечения, 1—2 раза в неделю. В первом случае яичники берут от животных после убоя, доставляют в лабораторию в термостатированном контейнере в течение 1,5—2,0 ч. В лаборатории яичники дважды промывают свежим фос­фатным буфером. Ооциты извлекают из фолликулов, диаметр которых 2—6 мм, путем отсасывания или разрезания яичника на пластинки. Ооци­ты собирают в среду ТСМ 199 с добавлением 10 % сыворотки крови от коровы в охоте, затем дважды промывают и отбирают для дальнейшего созревания in vitro только ооциты с компактным кумулюсом и однород­ной цитоплазмой.

В последнее время разработан способ прижизненного извлечения ооцитов из яичников коров с помощью ультразвукового прибора или ла­пароскопа. При этом ооциты отсасывают из фолликулов, диаметр кото­рых не менее 2 мм, 1—2 раза в неделю от одного и того же животного. В среднем получают однократно 5—6 ооцитов на животное. Менее 50 % ооцитов пригодны для созревания in vitro.

Положительное значение - несмотря на низкий выход ооцитов, при каждом извлечении возмож­ность многократного использования животного.

Капацитация сперматозоидов.Важным этапом в разработке метода оплодотворения у млекопитающих было открытие явления капацитации спермиев. В 1951 г. М.К. Чанг и одновременно с ним Г.Р. Аустин устано­вили, что оплодотворение у млекопитающих наступает только в том слу­чае, если спермин в течение нескольких часов до овуляции находятся в яйцеводе животного. Основываясь на наблюдениях по изучению проник­новения спермиев яйцеклетки крысы в различные сроки после спарива­ния Аустин ввел термин капацитации. Он означает, что в спермин долж­ны произойти некоторые физиологические изменения до того, как сперматозоид приобретет способность к оплодотворению.

Разработано несколько методов капацитации эякулированных спер­миев домашних животных. Для удаления белков с поверхности спермиев, которые, по-видимому, тормозят капацитацию спермиев, была использо­вана среда с высокой ионной силой.

Однако наибольшее признание получил способ капацитации сперма­тозоидов с использованием гепарина (Дж. Парриш и др., 1985). Пайеты с замороженным семенем быка оттаивают в водяной бане при 39°С в тече­ние 30—40 с. Примерно 250 мкл оттаянного семени подслаивают под 1 мл среды для капацитации. Среда для капацитации состоит из модифи­цированной среды Тиройда, без ионов кальция. После инкубации в течение одного часа верхний слой среды объемом 0,5—0,8 мл, содержащий большинство подвижных сперматозоидов, удаляют из пробирки и про­мывают дважды центрифугированием при 500 g в течение 7—10 мин. По­сле 15 мин инкубации с гепарином (200 мкг/мл) суспензию разбавляют до концентрации 50 миллионов сперматозоидов в мл.

Оплодотворение in vitro и обеспечение ранних стадий развития эмбрионов.Оплодотворение яйцеклеток у млекопитающих осуществля­ется в яйцеводах. Это затрудняет доступ исследователя к изучению усло­вий среды, в которой происходит процесс оплодотворения. Поэтому сис­тема оплодотворения in vitro была бы ценным аналитическим инструмен­том для изучения биохимических и физиологических факторов, вклю­чающихся в процесс успешного соединения гамет.

Применяют следующую схему оплодотворения in vitro и культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота. Оплодотворение in vitro проводят в капле модифициро­ванной среды Тироида. После созревания in vitro ооциты частично очи­щают от окружающих экспандированных кумулюсных клеток и перено­сят в микрокапле по пять ооцитов в каждой. Суспензия сперматозоидов объемом 2—5 мкл добавляется к среде с ооцитами, чтобы достичь кон­центрации сперматозоидов в каплях 1—1,5 млн/мл. Через 44—48 ч после осеменения определяют наличие дробления ооцитов. Затем эмбрионы помещают на монослой эпителиальных клеток для дальнейшего развития в течение 5 дней.