Микроскопическое исследование

Исследовать взятые пробы под микроскопом можно в не­окрашенных (нативных) и окрашенных препаратах.

При исследовании неокрашенных препаратов наряду с эле­ментами гриба в патологическом материале можно обнаружить клетки эпителия, крови, некротизированные ткани, растительные и иные загрязнения) попадающие из внешней среды и затрудняющие исследование. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерация) мате­риала, его концентрирование или, наоборот, разведение. Су­ществует несколько методов приготовления препаратов в за­висимости от вида микоза и характера исследуемого мате­риала.

Для приготовления и исследования нативного материала при дерматомикозах пораженные грибом волосы, ногтевые пластинки и чешуйки кожи необходимо соответствующим спо­собом подготовить.

Ногтевые пластинки, плотные роговые на­слоения кожи, длинные волосы (при фавусе) измельчают в чашке Петри или па предметном стекле нагретым скальпелем. Короткие (при трихофитии и микроспории) 2-3 волоса бе­рут для исследования, помещают на середину предметного стекла. Для мацерации наносят на патологический материал 1-2 капли щелочи (10-30% КОН или NaOН). Микроскопию производят через 10-15 мин. Надо учитывать, что приготов­ленные в щелочи препараты длительному хранению не подле­жат. Их лучше всего исследовать в течение 2 ч с момента при­готовления: в последующем меняется микроскопическая кар­тина, а выпадающие кристаллы щелочи мешают исследова­нию. Для ускорения просветления препаратов их подогревают. Без подогревания просветления можно достичь обработкой в течение 20 мин следующими растворами: хлораллактофенолом по Аману (две весовые части хлоралгидрата и фенола на одну часть молочной кислоты); лактофенолом (20 г фенола, 20 г молочной кислоты, 20 г воды, 40 г глицерина и 0,5 г синьки для хлопчатобумажных тканей); раствором, содержа­щим по 15% диметилсульфоксида и КОН в воде. Оптимальный срок исследования приготовленных такими спо­собами препаратов 3 ч. Хорошее просветление получают при применении 20% раствора щелочи с последующим прогрева­нием в течение 30 мин в термостате при 37°С; затем материал лучше всего исследовать в 50% растворе глицерина. Иногда для этих же целей пользуются 10% раствором КОН в глицери­не с прогреванием в течение 20 мин.

Препараты из чешуек кожи, залитые щелочью, до наложе­ния покровного стекла лучше подогреть над пламенем горелки (спиртовки), не доводя щелочь до кипения. При исследовании более грубых роговых масс с кожи подошв и ладоней или час­тиц (кусочков) ногтя можно пользоваться обогащением по Черногубову (кипячение в 10% растворе щелочи на водяной бане до образования гомогенной массы с последующим центрифугированием) или упрощенной модификацией этого метода — обработкой материала 10-20% растворами щелочи в центрифужной пробирке в течение 18-24 ч при комнатной температуре. Затем образующийся на дне осадок пастеровской пипеткой переносят на предметное стекло, накрывают покров­ным стеклом и просматривают в светлом поле микроскопа вначале под малым увеличением с опущенным конденсором или в слегка затемненном прикрытием аппертурной дпафрагмой поле для лучшей контрастности контуров гриба, а затем пол большим увеличением.

Комочки мокроты, гной помещают в каплю раствора Люголя, 10-20% щелочи, 50% спирта или глицерина и исследуют через 10 мин. Центрифугат ликвора, желчи, мочи просматривают этим же способом или просто в раздавленной капле. Подробно взятие материала при диагностике кандидоза, криптококкоза, гистоплазмоза, кокцидиоидоза и других глубоких микозов дано в соответствующих разделах специальной части. Нативные препараты можно исследовать и под фазово-контрастным микроскопом. Для этого волосы, чешуйки кожи и частицы ногтей после обработки 10% раствором КОН про­мывают стерильной водой или изотоническим раствором нат­рия хлорида 2-3 раза под покровным стеклом (с другой сто­роны накладывают фильтровальную бумагу), затем вводят под стекло спирт-глицериновую смесь (1:1). При исследова­нии гноя (при гистоплазмозе, кокцидиоидозе, криптококкозе) в раздавленной капле материал предварительно разводят изо­тоническим раствором натрия хлорида. Просматривают под микроскопом при увеличении в 200 и 400 раз.

Одним из простых методов приготовления препаратов из пораженных грибом волос пли чешуек кожи (ногтей) для учебных целей со сроком хранения в чашках Петри до 6 мес является обработка материала на предметном стекле 5-15% раствором Na₂S. Волосы обрабатывают 2 мин, материал с ногтей — 1 ч, затем фильтровальной бумагой осторожно снимают излишек раствора, а па препарат наносят каплю спирт-глице­риновой смеси (1:1), накрывают покровным стеклом, а края обмазывают (заливают) бальзамом, парафином, сургучом.

Уже при микроскопическом исследовании пораженного грибом волоса часто можно определить родовую принадлеж­ность дерматофита. Например, при поверхностной и хрониче­ской трихофитии, вызываемой Trichophyton violaceum и Т. tonsurans, элементы гриба, в основном споры, цепочками располагаются внутри волоса по типу «эндотрикс» (рис. 18). Граница волоса четкая, ясная (оболочка его сохранена), споры крупные, круглые, иногда неправильных округлых очерта­ний, тянутся тяжами, за пределы волоса не выходят (напоми­нают пробирку, заполненную горохом). В таком случае лабо­ратория дает ответ: «Найден трихофитон эндотрикс». Видовую принадлежность гриба определяют только на основании иден­тификации культуры, выросшей при посеве пораженного во­лоса на питательные среды.

Рис. 18. Поражение волоса трихофитоном по типу «эндотрикс»: а – схема; б – микрофотография.

При инфильтративно-нагноительной трихофитии, обуслов­ленной Tricho-phyton verrucosum и Т. mentagrophytes, car. gypseum, споры грибов располагаются цепочками снаружи волоса — поражение по типу «эктотрикс» (рис. 19). Контуры волоса нечеткие, сма­занные.

Рис. 19. Поражение волоса трихофитоном по типу «эктотрикс»: а – схема; б – микрофотография.

Споры у Т. verrucosum крупные, у Т. gypseum мелкие, похожие на споры грибов рода Microsporum. Поэтому в первом случае лаборатория дает ответ: «Найден трихофитон эктотрикс мегаспорой», или «крупноспоровый» (рис. 20), во втором — «Найден трихофитон эктотрикс микроидес», или «мелкоспоро­вый» (рис. 21).

Рис. 20. Поражение волоса Trichophyton ectotrix megasporum (схема)	Рис. 21. Поражение волоса Trichophyton ectotrix microides (схема)

Споры у возбудителей микроспории располагаются на по­верхности волоса хаотично и цепочек не образуют — видна «мозаика» (рис. 22). При легком раздавливании волоса под покровным стеклом можно видеть находящийся внутри волоса толстый мицелий микроспорума. Ответ лаборатории при этом должен быть «Найден микроспорум».

Рис. 22. Поражение волос при микроспории: а – схема; б – вид пораженного волоса в сканирующем микроскопе, х19 000

При фавусе волосы не обламываются, элементы гриба расположены внутри волоса и заполняют его не полностью. При микроскопическом исследовании обнаруживается поли­морфизм этих элементов: встречаются длинные и короткие, толстые, тонкие нити мицелия, крупные и мелкие, сгруппи­рованные и разрозненные, круглые, овальные и полигональ­ные споры. Мицелий разделен перегородками на фрагменты разной величины. Наряду с элементами гриба встречаются и негрибковые элементы: пузырьки воздуха и капельки жира. Все это создает своеобразную картину поражения волоса (рис. 23). Заключение лаборатории: «Найден волос, поражен­ный по типу ахорион» (возбудитель фавуса).

Рис. 23. Поражение волоса при фавусе: а, б – схема; в - микрофотография

В чешуйках кожи и ногтей иногда обнаруживают ветвя­щийся, а также артроспоровый мицелий, по которому нельзя определить не только видовую, но и родовую его принадлеж­ность. Лаборатория может дать только такой ответ: «Найден мицелий гриба» (рис. 24). При обнаружении округлых оди­ночных, но чаще сгруппированных элементов дрожжеподобных грибов дают ответ: «Найдены группы почкующихся (дрожже­вых) клеток» (рис. 25).

Во всех случаях грибкового поражения вид гриба уточня­ется только после посева на питательные среды, по характеру выросшей культуры, а для грибов рода Candida — с учетом до­полнительных критериев, изложенных в специальной части данного руководства.

При исследовании чешуек кожи, взятых с кожи стоп и кис­тей, иногда обнаруживают образования, напоминающие сплетения мицелия гриба, но являющиеся продуктом дегенерации холестерина в коже. Этот артефакт обычно называют мозаичным грибом (рис. 26). Большой полиморфизм в форме и величине отдельных его «члеников», расположение их в виде сеточки или петель, повторяющих контуры клеток ткани, в которых они расположены, более слабое преломление света отличают его от истинного гриба.

а
	Рис. 25. Группы почкующихся клеток дрожжеподобных грибов в дуоденальном содержимом.

б
Рис. 24. Мицелий гриба в чешуйке: а – микрофотография; б – в электронном сканирующем микроскопе, х 19 000	Рис. 26. Мозаичный гриб в чешуйке кожи

Приготовление окрашенных препаратов чаще необходимо при изучении отделяемого язв, свищей, соскобов с поверхности грануляций, реже – другого материала, взятого от больных дерматомикозами, для лучшего выявления элементов гриба, чем в нативных препаратах.

Вязкий и жидкий материал размазывают по поверхности предметного стекла тонким слоем, соскобы с гранулирующих поверхностей предварительно разделяют препаровальными иглами. После этого мазки фиксируют формалином, смесью Никифорова (спирт и эфир поровну), смесью Карнуа (10 г ледяной уксусной кислоты, 60 мл спирта и 30 мл хлороформа), и др., затем сушат и окрашивают.