Клеточная культура фибробластов крысы.

Для оценки цитотоксичности исследуемых соединений были выбраны фибробласты теменной кости крысы. Фибробласты легко поддаются культивации in vitro и являются стандартным объектом при доклинических испытаниях[21].

Для получения культуры извлекали в асептических условиях ламинарбокса теменную кость новорожденной крысы, измельчали стерильными ножницами на фрагменты 1- 2мм³ . Затем среду с фрагментами ткани наносили на дно плоскодонных культуральных пластиковых флаконов «Costar» Использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% ермоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотика – гентамицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл.

Через неделю наблюдали образование на поверхности флакона участков клеточного монослоя, растущего из прикрепленных фрагментов. Клетки для равномерного распределения подвергали обработке трипсином и еще через 1 неделю получали монослойную культуру (рис.9)

Рис.5. Монослойная культура клеток нормальных фибробластов

Культивирование клеток осуществлялось в пластиковых флаконах в стерильных условиях, клетки инкубировались при 37ºС в условиях 5% СО₂. При культивировании клеток использовали стандартную среду DMEM с добавлением 20% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина в концентрации 100 мкг/мл и антибиотиков – гентамицина сульфата и стрептомицина сульфата – в концентрации 40 мкг/мл.

Работа с клетками производилась в асептических условиях с использованием ламинарного бокса ЛС (Россия). При перенесении клеток из одного флакона в другой, или из флакона в планшет, производились следующие операции: сначала из флакона удалялась среда. Затем, оставшийся монослой клеток промывался 2 раза раствором Версена, и 2 раза 0,25% раствором трипсина, после чего флакон с остатками трипсина на слое клеток помещался в термостат, при температуре 37 С на 3-5 мин. После такой обработки, клетки теряли сцепление с поверхностью флакона, что позволяло смыть их струей среды из шприца, и получить суспензию, которую затем переносили в другой флакон или планшет.