МТТ-тест

МТТ-тест является стандартным методом проверки цитотоксичности различных соединений. Также, в клинической практике, этот тест применяется для определения лекарственной чувствительности опухолей. При этом тест ставится на культуре клеток, полученных в результате взятия биопсии, либо при хирургическом удалении опухоли. Он технически прост, чувствителен и воспроизводим[50].

Метод МТТ-теста основан на способности бесцветной соли тетразолия (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия бромид, МТТ) восстанавливаться до окрашенного формазана в присутствии митохондриальных ферментов живых клеток.

Рис.6. Восстановление 3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолий бромистого (бледно-желтая соль) до формазана с синей окраской.

В каждую ячейку 96-луночного планшета помещалась суспензия клеток в количестве 200 мкл. Клетки инкубировались в среде DMEM с глютамином, с добавлением сыворотки при температуре 37 С в течение 24х часов. Затем вносились исследуемые вещества – различные разведения стандартного образца. Планшет с внесенным образцом инкубировался в течение заданного времени (от 2х до 72 часов). В каждую ячейку вносилось по 10 мкл раствора МТТ в концентрациии 10 мг/мл (т.е. по 100 мкг МТТ). Инкубация продолжалась 2-4 часа, после чего можно было наблюдать изменение цвета среды в ячейках, и, микроскопически, темно-синие кристаллы формазона в клетках. Затем, из ячеек удалялась среда, при этом слой клеток с кристаллами формазона становится виден в виде синего налета на дне планшета. В каждую ячейку вносилось 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО). В течение 5-10 минут формазан растворялся в ДМСО, после чего по 100 мкл раствора отбиралось в чистый планшет для измерения. Измерялась оптическая плотность раствора формазона, при длине волны 530нм, с помощью планшетного спектрофотометра УНИПЛАН.