Как выбрать ПЦР-набор

С ростом популярности метода ПЦР неизбежно растет и предложение тест-наборов, в том числе и отечественного производства. Неподготовленному потребителю довольно трудно разобраться в качестве того или иного предлагаемого на рынке диагностического набора, независимо от наличия прилагаемых документов и коммерческой активности фирмы-производителя. В такой ситуации можно лишь порекомендовать потребителям самим испытать разные тест-системы и сравнить их качество.

Критериями такой проверки служат, в первую очередь, специфичность и чувствительность тест-наборов. К сожалению, далеко не все тест-наборы имеют заявляемые характеристики.

Чувствительность можно проверить, приготовив несколько десятикратных разведений выделенной ДНК (например, из коллекционного штамма микроорганизма или из клинического образца, в котором достоверно имеется искомый возбудитель, что подтверждено альтернативными методами исследований) и сравнив результаты амплификации. Если при этом один набор, уступая другому по чувствительности, дает больше положительных результатов на клинических образцах, следует задуматься о его специфичности.

Вероятны случаи, когда положительные результаты, полученные после амплификации с использованием разных тест-систем, частично или полностью не совпадают. Производитель, защищая свою продукцию, может утверждать, что даже при отсутствии клинических признаков, получаемые положительные результаты лишь свидетельствуют о высокой чувствительности тест-системы. При несовпадении результатов с другим, более чувствительным, набором необходимо все же убедиться, что выявляется именно искомый микроорганизм, а не что-то иное.

Следует также помнить, что наличие только одних клинических признаков не может служить доказательством присутствия предполагаемого микроорганизма. На первых порах для подтверждения качества используемой тест-системы рекомендуется сравнивать получаемые результаты с альтернативными методами исследований.

Возможна и обратная ситуация, когда выигравшая по чувствительности тест-система недостаточно специфична. В этом можно убедиться, проводя реакцию используя панель близкородственных микроорганизмов.

В некоторых случаях при использовании тест-системы, имеющей высокую чувствительность, возможно недовыявление положительных образцов, как следствие выбора праймеров в регионах ДНК, где вероятны мутации. Иногда критичной для реакции становится замена нуклеотидов в местах отжига праймеров.

К сожалению, далеко не всегда и не у всех есть возможность экспериментировать с приобретаемыми тест-наборами. В этом случае весьма полезно попытаться выяснить у производителя как создавалась и проверялась предлагаемая тест-система.

ВИДЫ ПЦР

• RT-PCR - от слов Reverse Transcription, исходный продукт РНК, который переводится в кДНК, далее ведётся ПЦР.
• real-time PCR - когда наблюдают за реакцией в реальном времени, непосредственно измеряя накопление продукта ПЦР в каждом цикле. Принципиальной особенностью метода ПЦР в режиме реального времени в отличие от классической ПЦР является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.
• PCR-RFLили PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism Assay, по русски: ПЦР-ПДРФ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) - когда сначала проводят ПЦР, а потом - рестрикцию полученного ПЦР-продукта.

Ампликон (Амплификат) -ПЦР-продукт, наработанный в процессе реакции

Амплификатор -Прибор, предназначенный для проведения ПЦР.

Банд -Полоска ампликона на электрофореграмме.

Зона насыщения -Предельное количество циклов (n), при котором на электрофорезе хорошо виден ампликон. Превышение "n" приводит к появлению шмера и неспецифике

Не специфика -Образование ампликонов, размер которых не соответствует теоретически расчитанному размеру. Причём, их может быть много (до 5-10 штук), они могут иметь чётко очерченные края, но могут быть и туманными.

Полимераза -Taq-полимераза - обычно используется для проведения ПЦР. Позволяет получать фрагменты до 5 т.п.н. Не обладает "проверочной" активностью, т.е. работает быстро, и может допускать включение в цепь ошибочных нуклеотид трифосфатов. Отлично подходит для рутинных анализов.

Colored Taq-полимераза - таже Taq-полимераза, но с некой добавкой, которая позволяет наносить ПЦР-продукт в лунку агарозы без добавки красителя, что облегчает анализ, особенно при большом количестве образцов

Tht-полимераза - обычно применяют для постановки реакции обратной транскрипции (РОТ) с последующей ПЦР, когда размер фрагмента в РОТ не превышает 800 п.н.

Hi-Fi-полимераза - улучшенный вариант Taq-полимеразы, читает более точно и даёт выход ПЦР-продукта более высокий, чем Taq-полимераза в тех же случаях

LR-полимераза - фермент для "длинного" чтения (более 5 тыс. п.н.). Требует соблюдения особых условий при постановке ПЦР

Pfu-полимераза - идеальный фермент для точного чтения коротких фрагментов (менее 2 тыс. п.н.)для последующего клонирования, экспрессии, секвенирования