Подбор праймеров

Размер праймера должен быть 16-25 нуклеотидов. Меньше 16-ти: слабая связь с целью

 Разница в температуре плавления праймеров - не более 6 градусов

 Ц+Г должно быть 50-60 %

 Для улучшения качества отжига рекомендуется подбирать праймеры так, чтобы последние несколько нуклеотидов 3' - конца праймера содержали GC-основания

 Проверь сбалансированность PCR по нуклеотидам и праймерам Расчёт параметров ПЦР

 Отсутствие внутренней вторичной структуры (праймеры не должны быть само- и взаимнокомплиментарными)

 Отсутствие комплементарности между 3'-концами (чтобы не образовывалось праймер-димеров)

 Оптимальная концентрация праймеров подбирается эмпирически, но не должна быть больше 50 пикомолей на пробирку - иначе начнётся неспецифический отжиг праймеров

 Упрощенный расчет оптимальной температуры отжига праймера:
Tm = [(A+T) x 2 °C] + [(G+C) x 4 °C](если суммарная длина олигонуклеотида не превышает 20 оснований)
Tm = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T))(если суммарная длина олигонуклеотида составляет 20-30 оснований)

 Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций, делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров, специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие - ложноотрицательный результат

Секвенирование биополимеров(белков и нуклеиновых кислот — ДНК и РНК) — определение их первичной аминокислотной илинуклеотидной последовательности (от англ. Sequence — последовательность). В результате получается линейное символьное описание, которое сжато резюмирует атомную структуру молекулы.

Для секвенирования применяются методы Эдмана, Сенгера и другие; в настоящее время для секвенирования нуклеиновых кислот обычно применяется метод Сенгера с дидезоксинуклеозидтрифосфатами (ddNTP). Обычно до начала секвенирования производят амплификацию участка ДНК, последовательность которого требуется определить при помощи ПЦР.

Дезоксинуклеотидный метод, или метод «обрыва цепи», был разработан Ф. Сенгером в 1977 году и в настоящее время широко используется для определения нуклеотидной последовательности ДНК. При дидезокси-секвенировании происходит гибридизация синтетического олигонуклеотида длиной 17—20 звеньев со специфическим участком одной из цепей секвенируемого участка. Этот олигонуклеотид является праймером, поставляющим 3'-гидроксильную группу для инициации синтеза цепи, комплементарной матрице

Раствор с праймером распределяют по четырем пробиркам, в каждой из которых находятся четыре дезоксинуклеотида, dATP, dCTP, dGTP и dTTP (один из них — меченный радиоактивным изотопом) и один из четырех 2',3'-дидезоксинуклеотидов (ddATP, ddTTP, ddGTP или ddCTP). Дидезоксинуклеотид включается по всем позициям в смеси растущих цепей, и после его присоединения рост цепи сразу останавливается. В результате этого в каждой из четырех пробирок при участии ДНК-полимеразы образуется уникальный набор олигонуклеотидов разной длины, включающих праймерную последовательность. Далее в пробирки добавляют формамид для расхождения цепей и проводят электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках. Проводят радиоавтографию, которая позволяет «прочесть» нуклеотидную последовательность секвенируемого сегмента ДНК.

В более современном варианте дидезоксинуклеотиды метят четырьмя разными флуоресцентными красителями и проводят ПЦР в одной пробирке. Затем во время электрофореза в полиакриламидном геле луч лазера в определенном месте геля возбуждает флуоресценцию красителей, и детектор определяет, какой нуклеотид в настоящий момент мигрирует через гель. Современные приборы используют для секвенирования ДНК капиллярный электрофорез.

Бромистый этидий, EtBr

Спектр поглощения бромистого этидия

Бромистый этидий (3,8-Диамино-5-этил-6-фенилфенантридиум бромид, EtBr, Ethidium bromide) — интеркалирующий агент, широко применяемый для выявления нуклеиновых кислот вмолекулярной биологии, в частности, в случае ДНК электрофореза в агарозном геле.

При освещении ультрафиолетовым светом, EtBr флюоресцирует оранжевым цветом, интенсивность флюоресценции увеличивается примерно в 20 раз при связывании с ДНК.

Под названием Homidium, бромистый этидий использовался для лечения Трипаносомоза у рогатого скота в 1950х годах.

Из-за возможности связывания с ДНК, и при освещении ультрафиолетом, стимулирования разрывов в ДНК, бромистый этидий может быть сильным мутагеном. Также считается канцерогеном и тератогеном, хотя эти свойства никогда не были тщательно исследованы.

Фотография агарозного геля после ДНК-электрофореза.

Результат электрофоретического разделения продуктов ПЦР-реакции. Агарозный гель окрашен бромистым этидием. Визуализация посредством облучения ультрафиолетом с длинной волны 312нм.

Электрофорез ДНК — это аналитический метод, применяемый для разделения фрагментов ДНК по размеру (длине). Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода, заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее.

После разделения (иногда краситель вносят в расплавленную агарозу) фрагменты ДНК разной длины визуализируют при помощи флюоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК, например, агарозные гели обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка»), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины.

Для ДНК электрофорезов обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) иполиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случаесеквенирования) гели.

, ПЦР в реальном времени, количественный ПЦР.

В молекулярной биологии, ПЦР в реальном времени (или количественный ПЦР) — лабораторный метод, основанный на методе ПЦР, используется для одновременной амплификации и измерения количества заданной молекулы ДНК. Метод ПЦР в реальном времени включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.

Метод в общем использует общие принципы ПЦР, основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода —флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК и модифицированные дезокси-нуклеотиды, которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Часто ПЦР в реальном времени комбинируют с ОТ-ПЦР (обратная транскрипция) для измерения малых количеств мРНК, что позволяет исследователю получать количественную информацию о содержании данной мРНК в клетке и, соответственно, позволяет судить об уровне экспрессии данного гена в отдельной клетке или ткани.