![]() КАТЕГОРИИ:
АстрономияБиологияГеографияДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника
|
Ход работы. Подготовка культуры.За 6-7 дней до проведения работы культура из исходной коллекционной пробирки, хранящейся в музее лабораторииПодготовка культуры.За 6-7 дней до проведения работы культура из исходной коллекционной пробирки, хранящейся в музее лаборатории, пересевается на свежий скошенный сусло-агар (5-6%-ное сладкое пивное сусло с добавлением 1,5-2,0% агара) в пробирки с большим диаметром (18 мм). Посевы микроорганизмов на косом сусло-агаре помещаются в термостат с температурой 30°С на 3-4 суток. Рост гриба заканчивается обильным спороношением. За 3 дня до начала основной работы повторно переселяют продуцент из пробирок на твердую питательную среду, обычно на увлажненные пшеничные отруби. Для этого в конические колбы вместимостью 250 см3 помещают по 15-20 г пшеничных отрубей влажностью 45%, закрывают их ватными пробками, надевают бумажный колпачок, чтобы не намокла пробка при стерилизации, а затем автоклавируют 1час при 120оС. После естественного охлаждения до 35-40°С среды в колбах её в стерильных условиях засевают суспензией спор микроскопического гриба. Суспензию спор получают, смывая спороносящую культуру продуцента с косого сусло-агара в большой пробирке 10 см3 стерильной воды. В каждую колбу со стерильной средой вносят по 1 см3 споровой суспензии. После тщательного перемешивания колбы с засеянной средой ставят в термостат с температурой 30°С на 2-3 суток. За это время мицелий гриба полностью пронизывает питательную среду, образуется рыхлый корж, густо покрытый конидиями гриба желто-зеленого цвета. Эта культура на отрубях, выращенная в колбах, является исходным посевным материалом для засева кювет во время лабораторных занятий. Посевной материал анализируется на микробиологическую частоту и на содержание конидий. Хороший посевной материал не должен содержать посторонней микрофлоры. Подготовка посуды к стерилизации. Вся посуда перед стерилизацией должна быть тщательно вымыта и высушена в сушильном шкафу. Металлическую кювету (рис. 1) перед стерилизацией в собранном виде вместе с крышкой и листом непроклеенной бумаги, но без питательной среды необходимо взвесить и записать эту массу (Р) в протокол наблюдений.
Рисунок 1 - Металлическая кювета с крышкой для выращивания микроорганизмов на твердой питательной среде поверхностным способом
Для стерилизации следует завернуть в бумагу, не нарушая ее целостности, и аккуратно завязать веревочками следующие предметы: кювету, крышку к кювете вместе с вырезанным по размерам крышки листом непроклеенной бумаги, низкий широкий сосуд вместимостью 1,5-2,0 дм3, где будет проводиться увлажнение среды и ее засев, мерный цилиндр на 250 см3 для замера необходимого количества стерильной воды, стеклянную палочку или лопатку для перемешивания посевной культуры в посевной колбе. Кроме того, следует простерилизовать в колбе 250 см3 водопроводной воды. Стерилизацию посуды и воды следует проводить в автоклаве при температуре 120°С в течение 0,5 ч. Стерильная посуда после автоклавирования должна быть подсушена в сушильном шкафу при 105°С, так как бумага при стерилизации слегка увлажняется.
Приготовление и стерилизация питательной среды.Для каждого конкретного микроорганизма готовится своя питательная среда, обладающая набором специфических соединений, обеспечивающих биосинтез определенных ферментов. Для Asp. oryzaе, например, используются следующие варианты питательных сред (в %): пшеничных отрубей - 100; пшеничных отрубей -70, свекловичного жома - 30; пшеничных отрубей - 80, выжимок винограда – 20; солодовых ростков - 50; рисовой шелухи- 50. Если задание связано с оптимизацией состава питательной среды, то каждый из перечисленных вариантов может служить центром эксперимента. Интервалы варьирования факторов студенты должны назначать самостоятельно с учетом физиологических особенностей продуцента и литературных данных. Если компонент среды имеет очень крупные частицы (например, подсолнечная лузга), его перед введением в среду измельчить. Компоненты среды отвешиваются на технических весах, тщательно перемешиваются и после этого из смеси отбирается средняя проба для последующих анализов, обычно она составляет около 40-60 г. На эту величину следует увеличивать рассчитанную для опыта массу. Например, опыт проводится в трех параллельных опытах, в каждую кювету входит 80 г среды (по воздушно-сухой массе), 240 г на три кюветы. Тогда общее количество приготовляемой среды будет 300 г. Среда для каждой кюветы стерилизуется отдельно. Приготовленная среда помещается либо в пакет, либо в многослойную салфетку из марли, либо в широкий стеклянный стакан. Емкость для стерилизации предварительно должна быть взвешена. Стерилизация среды ведется при 120°С в течение 1 часа в биксе. Емкость со стерильной средой вновь взвешивается (В). Определение исходной влажности среды (W исх.) и содержания в ней основных лимитирующих процесс роста микроорганизма компонентов. Определение влажности сыпучей среды ведется в трех параллельных пробах по ускоренной методике, на приборе Чижовой, в сушильном шкафу с ИК-лампой либо высушиванием до постоянной массы. Лимитирующими компонентами в среде могут быть источники углерода, азота, некоторые соли. Чаще всего при поверхностном способе культивирования большое значение имеет наличие в среде крахмала, целлюлозы, гемицеллюлозы, пектина, которые не только являются источником питания, но и способствуют образованию микроорганизмом определенных ферментов. Например, для получения амилолитических ферментов необходимо наличие в среде значительных количеств крахмала, а для пектолитических ферментов наряду с крахмалом в среде должно быть повышенное содержание пектина и т.п. В зависимости от поставленной задачи определяют наиболее важное лимитирующее рост микроорганизма соединение и биосинтез требуемого им комплекса. Расчет количества воды, необходимой для увлажнения питательной среды. Для нормального развития микроскопического гриба и интенсивного образования ферментов необходимо, чтобы среда имела влажность 58-63%. Расчет количества добавляемой воды проводится по следующим данным: Аср - масса питательной среды с исходной влажностью W исх. Вср - содержание абсолютно сухого вещества в исходной пробе Сср - масса питательной среды с требуемой влажностью W тр., которая равна Вср х 100 : (100- W тр) = ССР ; Гср - масса питательной среды после стерилизации, равная (В-а) = ГСР ; Д - количество воды, которое необходимо добавить для получения питательной среды требуемой влажности, равное (Сср - Гср) = Д. Увлажнение стерильной питательной среды, засев ее чистой культурой продуцента и раскладка засеянной среды в кюветы для выращивания. Эти операции выполняются с соблюдением правил асептики при горящем факеле или с использованием газовой горелки. Засев может быть осуществлен в специальном, предназначенном для посевов, помещении бокса, который перед посевом облучается бактерицидными лампами в течение 2,5-3,0 часов. На чистом столе помещается вся необходимая стерильная посуда: колба со стерильной водой, питательная стерильная среда в перфорированной емкости в биксе, кювета, крышка, завернутые в бумагу стеклянная палочка и колба с посевной культурой гриба. Руки работающих должны быть защищены резиновыми перчатками, которые тщательно протираются этиловым спиртом. Увлажнение и засев осуществляют в следующем порядке. Осторожно частично разворачивают пустой сосуд вместимостью 1,5-2,0 дм3 и в него высыпают питательную стерильную среду. Частично разворачивают цилиндр и в непосредственной близости от огня в него наливают рассчитанное количество стерильной воды (Д). Затем с соблюдением правил асептики открывают колбу с посевным материалом, вносят стерильную палочку и наливают приблизительно 2/3 объема отмеренной стерильной воды из цилиндра. Содержимое колбы перемешивают палочкой с водой и в виде водной суспензии переносят в сосуд со средой. Затем посевную колбу еще раз ополаскивают оставшейся в цилиндре водой, которую присоединяются к увлажняемой среде. Пустую колбу с оставшейся в ней стеклянной палочкой закрывают пробкой. Содержимое сосуда тщательно перемешивают рукой в резиновой перчатке. Такое перемешивание необходимо для того, чтобы влага и посевной материал равномерно распределились по всей массе среды. Засевную среду переносят в заранее взвешенную стерильную кювету (В), равномерно распределяют в ней и закрывают кювету сначала листом непроклеенной бумаги, а затем крышкой. Закрытую кювету со средой взвешивают (К). Затем кювету надписывают простым карандашом и помещают в специальную растильную камеру или термостат.
Определение массы сырой готовой культуры. Из первого занятия известны масса пустой кюветы и листа непроклеенной бумаги (Р), масса влажной среды в кювете (Мвл) и масса сухого вещества среды в кювете (Мсв). Из массы кюветы с культурой (K) вычитается масса пустой кюветы (Р), и получается масса сырой готовой культуры (Ак) в граммах: Ак = К - Р. Данные заносят в таблицу 1 представленную ниже.
Определение влажности культуры и расчет ее выхода от массы исходной питательной среды.Сырую культуру гриба вынимают из кюветы и переносят в широкую емкость типа кристаллизатора, где тщательно измельчают и перемешивают. Отбирают среднюю пробу, из которой отвешивают с точностью до сотых две-три навески для определения влажности по ускоренной методике на приборе Чижовой или методом высушивания до постоянной массы в сушильном шкафу. Таблица 1 – Результаты исследований
Выход культуры определяют по следующей схеме: рассчитывается содержание сухого вещества в готовой культуре (Вк) по формуле Вк = Ак (100 - WK.cp): 100. Из предыдущего занятия известно содержание сухого вещества в исходной среде (Мсв). Выход культуры в % по отношению к исходной среде составит Пример: Известно, что М = 270,0г; Р = 160,0; Wk.cp = 46% Мсв = 80,0г. Требуется определить Ак, Вк и Ак = 270 - 160 = 110г; Вк = 110 (100-46) : 100 = 59,4г;
Определение активностей ферментов в культуре.В зависимости от вида продуцента и синтезируемых им ферментов выбирается метод определения активности. Следует позаботиться о наличии оценки ошибки метода определения активности. Если такой оценки в литературе нет, то, осуществив 5-6 определений активности в одном и том же препарате, можно эту оценку получить. Необходимо для дальнейших расчетов знать влажность культуры, величину навески, взятой для приготовления вытяжки из культуры, количество вытяжки, используемой для определения активности, и доверительные ошибки этих величин. Активность культуры выражается в единицах ферментативной активности (ФА) на 1 г влажной и сухой культуры. Данные заносятся в таблицу 2.
Таблица 2 – Результаты исследований
Работа заканчивается подробными выводами.
Контрольные вопросы 1 Особенности ферментов микроорганизмов. 2 Ферменты микроорганизмов, применяемые в производстве. 3 Способы получения активных ферментов. 4 Выделение и стабилизация ферментов. 5 Области применения ферментов. 6 Методика работы.
|