Технологические особенности ферментации.

По технологическому оформлению различают следующие микробиологические процессы: аэробное и анаэробное культивирование; твердофазное, поверхностное и глубинное культивирование; периодическое и непрерывное культивирование.
Аэробное культивирование — аэрация среды — непременное условие в тех микробиологических процессах, в которых используются аэробные микроорганизмы-продуценты.
Потребность аэробных микроорганизмов в молекулярном кислороде зависит от окисляемого источника углерода и от физиологических свойств и активности роста микроорганизмов. Для биосинтеза 1 кг дрожжевой биомассы необходимо, например, 0,74–2,6 кг молекулярного кислорода. При интенсивном потреблении субстрата независимо от источника углерода продуцент ассимилирует 0,83–4,0 мг кислорода/1 л среды/мин.
Растворимость кислорода в среде сравнительно низка и зависит от температуры, давления и от концентрации растворенных, эмульгированных и диспергированных компонентов (табл. 1). При давлении 0,1 МПа и температуре 30°С в 1 л дистиллированной воды максимальное количество растворенного кислорода составляет 7,5 мг. В реальной питательной среде максимальная растворимость кислорода колеблется в интервале 2–5 мг/л. Запасы кислорода в среде обеспечивают жизнедеятельность аэробного продуцента в течение 0,5–2 мин.
При глубинном культивировании запасы кислорода в питательной среде возобновляются при подаче аэрирующего воздуха. Скорость абсорбции кислорода увеличивается с ростом интенсивности перемешивания среды (табл. 2).
Во время роста биомассы микроорганизмы обычно потребляют больше кислорода, чем во время сверхсинтеза целевого метаболита. Принято говорить о критической концентрации кислорода, при которой наблюдается лимитация дыхания клеток. Для большинства аэробных микроорганизмов, растущих в сахаросодержащих субстратах, критическая концентрация кислорода 0,05–0,10 мг/л, что соответствует 3–8 % от полного насыщения среды кислородом. Лимитация роста и физиологической деятельности клеток наблюдается при более высоких концентрациях кислорода: на средах с глюкозой рост дрожжей лимитируется при рО2 на уровне 20–25 % от полного насыщения.
Оптимальной для роста биомассы считается концентрация кислорода 50–60 % от полного насыщения, для биосинтеза целевых метаболитов — 10–20 %.

Анаэробные процессы биологического окисления у гетеротрофных микроорганизмов в зависимости от того, что является конечным акцептором водородных атомов или электронов, делят на три группы: дыхание (акцептор — кислород); брожение (акцептор — органическое вещество) и анаэробное дыхание (акцептор — неорганическое вещество : нитраты, сульфаты и др.).
У облигатных анаэробов брожение является единственно возможным способом получения энергии; у факультативных анаэробов оно составляет обязательную первую стадию катаболизма глюкозы, за которой может следовать аэробное окисление образовавшихся продуктов, если в среде присутствует кислород.
Обособленной промежуточной группой являются аэротолерантные микроорганизмы, получающие необходимую для жизнедеятельности энергию в анаэробном процессе, т. е. на уровне субстратного фосфорилирования, и одновременно имеющие дыхательную цепь для поглощения кислорода среды и создания благоприятных анаэробных условий. Данный эффект носит название «эффекта дыхательной защиты».
Примерами облигатно анаэробных процессов являются маслянокислое и метановое брожения. Универсальным для всех микроорганизмов, за небольшими исключениями, является катаболизм глюкозы — гликолиз до образования пирувата:
Глюкоза + 2АТР + 2 NAD = 2 Пируват + 4АТР + 2NADH + 2Н⁺
Возбудители спиртового брожения (дрожжи) после декарбоксилирования пирувата и образования ацетальдегида восстанавливают ацетальдегид до этанола. Молочнокислые бактерии гомогенного молочнокислого брожения восстанавливают пируват до молочной кислоты. Гетероферментативные молочнокислые бактерии сбраживают глюкозу по несколько отличающемуся пентозофосфатному пути с образованием молочной кислоты, а также уксусной кислоты, этанола и диоксида углерода.
Анаэробные условия на производстве создают герметизацией аппаратуры, продуванием среды инертными газами, в том числе газообразными продуктами, образовавшимися во время ферментации. Отсутствие необходимости аэрации среды несколько упрощает при анаэробной ферментации конструкцию ферментера (биореактора) и облегчает управление процессом.
Твердофазную ферментацию обычно реализуют в твердой, сыпучей или пастообразной среде, влажность которой составляет 30–80 %.
Различают три типа твердофазных процессов:
• поверхностные процессы: слой субстрата, например соломы, не превышает 3–7 см («тонкий слой»); роль биореактора выполняют большие, площадью до нескольких квадратных метров, подносы из алюминия или культивационные камеры);
• глубинные твердофазные процессы в неперемешиваемом слое («высокий слой»): биореакторы представляют собой глубокие открытые сосуды. Для аэробных процессов разработаны приспособления, обеспечивающие диффузионный и конъюктивный газообмен;
• твердофазные процессы в перемешиваемой и аэрируемой массе субстрата, которая может быть гомогенной или состоять из частиц твердого субстрата, взвешенных в жидкости.

Если субстрат сыпучий, то отдельные твердые частицы его хорошо контактируют с воздухом, рост микроорганизмов в этом случае происходит главным образом на поверхности твердых частиц, а также в порах, заполненных либо водой, либо воздухом. Обеспечение микроорганизмов кислородом затрудняется с увеличением слоя субстрата. Перемешивание слоя не допускается, если культивируются мицелиальные микроорганизмы, например микромицеты, и из-за отсутствия перемешивания рост микроорганизмов происходит по принципу колонизации, поэтому часто возникает локальная нехватка питательных веществ. Другая проблема при твердофазной ферментации — отвод теплоты и поддержание постоянной температуры во всей ферментационной среде.
Однако твердофазные процессы имеют и преимущества по сравнению с процессами, протекающими в жидкой среде:
• они требуют меньших затрат на Лабораторное оборудование и эксплуатацию;
• характер субстрата облегчает отделение и очистку продукта;
• низкое содержание воды в субстрате препятствует заражению культуры продуцента посторонней микрофлорой;
• твердофазные процессы не связаны со сбросом в окружающую среду большого количества сточных вод.

Управляемый процесс твердофазной ферментации в промышленных условиях осуществлен при производстве ферментов с использованием микромицетов. Сыпучий субстрат с культурой инкубируют в тонком слое (3–7 см) в кюветах, размещенных в камерах, где поддерживают оптимальные температуру и влажность воздуха, обеспечивают принудительную циркуляцию газовой фазы вдоль поверхности ферментируемого субстрата. Воздух в данном случае является и аэрирующим, и теплоотводящим агентом.
Более толстый слой гранулированного крахмалсодержащего субстрата используют для протеинизации (до 20 %) корма при помощи Asp. niger. В данном случае применяют неинтенсивное перемешивание среды.
Поверхностная ферментация на жидких субстратах реализуется в кюветах со средой, помещенных в вентилированные воздухом камеры. Культура микроорганизмов при этом образует биомассу в виде пленки или твердого слоя на поверхности жидкой среды. Культура потребляет кислород непосредственно из газовой фазы — воздуха. Массообмен в таких условиях малоинтенсивный.
Глубинное культивирование микроорганизмов происходит во всем объеме жидкой питательной среды, содержащей растворенный субстрат. Ферментер должен обеспечивать рост и развитие популяций микроорганизмов в объеме жидкой фазы, подвод питательных веществ к клеткам микроорганизмов, отвод от микробных клеток продуктов их обмена веществ (метаболизма), отвод из среды выделяемого клетками тепла.
Глубинное культивирование можно осуществлять периодическим и непрерывным способами.
Периодическое культивирование. При периодическом способе культивировании в ферментер загружают сразу весь объем питательной среды и вносят посевной материал. Выращивание микроорганизмов проводят в оптимальных условиях в течение определенного времени, после чего процесс останавливают, сливают содержимое ферментера и выделяют целевой продукт.
Этап роста культуры включает: лаг-фазу, экспоненциальную фазу, фазу замедления роста, стационарную фазу, фазу отмирания.
Широко применяют периодическое культивирование с подпиткой. Существует также объемно-доливочное культивирование, когда часть объема из биореактора время от времени изымается при добавлении эквивалентного объема среды (полунепрерывное культивирование).
Непрерывные процессы. При непрерывном способе питательная среда непрерывно подается в ферментер (биореактор), в котором создают оптимальные условия для роста микроорганизмов, а из ферментера (биореактора) также непрерывно вытекает культуральная жидкость вместе с микроорганизмами.
В непрерывных процессах биообъект поддерживается в экспоненциальной фазе роста. При этом существует равновесие между приростом биомассы за счет деления клеток и их убылью в результате разбавления свежей средой.
Из непрерывных процессов лучше всего изучен метод глубинной ферментации. Процесс может быть гомогенно или гетерогенно-непрерывным.
При гомогенно-непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры постоянны во времени.
При гетерогенно-непрерывном процессе несколько ферментеров соединены вместе. Питательная среда поступает в первый аппарат, готовая культуральная жидкость вытекает из последнего.
При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. обеспечить постоянную концентрацию клеток. В стерильных условиях непрерывный, проточный метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.
В зависимости от метода, благодаря которому культура поддерживается в состоянии динамического равновесия (когда μ = D), различают турбидостатный и хемостатный принципы.
При турбидостате скорость притока среды такова, что концентрация биомассы в системе постоянна; при хемостате в системе ограничивают рост культуры одним элементом питания (углерода, кислорода, соответствующего витамина и др.) при нелимитируемых количествах остальных. Известны также методы управления ростом проточной культуры по рН (рН-стат), по кислороду (оксистат).
В зависимости от цели производства — получение клеток или продуктов их жизнедеятельности — способы ведения основной ферментации различаются. Если процесс направлен на получение биомассы, то назначение ферментации — получить максимально возможный титр клеток, а в случае получения метаболитов их накопление осуществляют одновременно, причем максимумы образования продуцента и целевого продукта всегда сдвинуты по времени. Поэтому продолжительность ферментации в первом случае всегда меньше, чем во втором.
Если целью является получение биомассы промышленного штамма в периодическом процессе, то время культивирования не превышает 24 ч. При производстве первичных метаболитов время биосинтеза составляет 48–72 ч, а вторичных — 72–144 ч.
При культивировании различных микроорганизмов интервал рабочих температур варьирует в пределах 25–60°С, значения рН — 2÷9, расход воздуха в аэробных процессах — 0,15–2,5 м3/1 м3 среды/мин.

69. Что важно для аэробного культивирования?

Для роста микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы. При аэрации среды учитывают два показателя: интенсивность и степень аэрации. Интенсивность аэрации характеризуется скоростью растворения кислорода в единице объема культуральной жидкости за единицу времени. Степень аэрации – это объем воздуха, продуваемый через определенный объем среды за единицу времени.