ГЛАВА 11. Поскольку V. cholerae колонизирует слизистую кишечника, разумно было предположить, что наиболее эффективной будет пероральная противохолерная вакцина

Поскольку V. cholerae колонизирует слизистую кишечника, разумно было предположить, что наиболее эффективной будет пероральная противохолерная вакцина. Имея это в виду, создали штамм V. cholerae, из генома которого была делетирована часть кодирующей А₁-пептид нуклеотидной последовательности. Этот штамм не синтезирует энтеротоксин, а потому не является патогенным и подходит для создания живой вакцины.

Эксперимент состоял в следующем. В ген А₁-пептида V. cholerae был встроен ген устойчивости к тетрациклину. При этом прерывалась рамка считывания для Α₁-пептида, но штамм становился устойчивым к тетрациклину. Его нельзя было использовать в качестве вакцины и потому, что со временем происходила спонтанная утрата тетрациклинового гена, и синтез энтеротоксина восстанавливался. Чтобы обойти эту проблему, создали штамм с дефектной нуклеотидной последовательностью, кодирующей А₁-пептид, которая не могла восстанавливаться (рис, 11.6). Для этого использовали следующий подход,

1. Плазмиду, которая содержала сегмент ДНК, кодирующий А,-пептид, обработали рестри-цирующими эндонуклеазами С1аIи XbaI, каждая из которых расщепляла только кодирующую a₁-пептид последовательность вставки.

2. Чтобы замкнуть плазмиду в кольцо, к ClaI-сайту пришили ХbаI-линкер и обработали плазмиду рестриктазой XbaI.

3. С помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединили XbaI-сайты плазмиды. В результате из середины кодирующей А₁-пептид последовательности оказался удаленным сегмент длиной 550 п. н., соответствующий аминокислотным остаткам 183-194.

4. С помощью конъюгации перенесли эту плазмиду в штамм V. cholerae, несущий ген устойчивости к тетрациклину в локусе, кодирующем Α₁-пептид.

5. В результате рекомбинации между оставшейся в составе плазмиды частью последовательности, кодирующей А₁-пептид, и геном А,-пептида, прерванным Теt^г-геном, кодирующая А₁-пептид последовательность в хромосоме была замешена гомологичным плазмидным сегментом с делецией.

6. Внехромосомная плазмида не могла долго существовать в холерном вибрионе и через несколько поколений была утрачена.

7. Отобрали клетки с интегрированной дефектной А₁ -кодирующей последовательностью, используя их чувствительность к тетрациклину.

Полученный таким способом стабильный штамм с делегированной кодирующей А₁-пептид последовательностью не синтезировал активный энтеротоксин и при этом сохранял все остальные биохимические свойства патогенной формы V. cholerae. Проводимые в настоящее время клинические испытания эффективности этой формы как противохолерной вакцины пока не дали однозначного результата. Вакцина обеспечивает почти 90%-ную защиту от холеры, но у некоторых испытуемых наблюдаются побочные эффекты. Возможно, понадобится изменить другой хромосомный локус этого штамма, чтобы можно было использовать его как вакцину.

Противосальмонеллезные вакцины

Другой способ получения непатогенных штаммов, пригодных для создания на их основе живых вакцин, состоит в удалении из генома патогенных бактерий хромосомных областей, отвечающих за независимые жизненноважные функции. При этом лучше делетировагь по крайней мере две такие области, поскольку вероятность их одновременного восстановления очень мала. Предполагается, что штамм с двойной делецией будет обладать ограниченной пролиферативной способностью и сниженной патогенностью, но обеспечит выработку иммунного ответа.

Разные штаммы Salmonella вызывают острые кишечные инфекции, постнагальную инфекцию, брюшной тиф, пищевую токсикоинфек-цию. Для профилактики всех этих заболеваний совершенно необходимо иметь эффективную вакцину. Чтобы получить аттенуированные штаммы Salmonella, вносили делеции в гены ara, кодирующие ферменты биосинтеза ароматических соединений, и в гены pur, кодирующие ферменты метаболизма пуринов. Такие штаммы с двойной делецией вызывают легкую форму инфекции и обладают в 10⁶ раз меньшей вирулентностью. На их основе уже созданы эффективные