ГЛАВА 14. компоненту II, а также в биосинтезе железомолибденового кофактора.

компоненту II, а также в биосинтезе железомолибденового кофактора.

Генная инженерия кластера генов нитрогеназы

Фиксация азота — очень сложный процесс, требующий согласованного действия множества разных белков. Поэтому вряд ли можно было ожидать, что вся генетическая информация, необходимая для фиксации азота, будет содержаться в каком-то одном фрагменте ДНК и что этот фрагмент удастся вычленить из генома диазотрофного микроорганизма и перенести в недиазотрофный организм. Следует еще учесть, что физиологические условия в организме реципиента должны быть подходящими для функционирования активной нитрогеназы. Более приемлемый способ выделения генов азотфиксации (nif-генов) состоял в том, чтобы идентифицировать и охарактеризовать те клоны библиотеки ДНК дикого типа, которые восстанавливают способность различных мутантов данного микроорганизма фиксировать азот. Такой метод называется генетической комплементацией.

Первые nif-гены, идентифицированные методом комплементации, были выделены из банка клонов диазотрофиой бактерии Klebsiella pneumoniae. Эта хорошо изученная энтеробакте-рия, которая обнаруживается в почве и воде, а также в кишечнике человека. Схема выделения состоит в следующем (рис. 14.3).

1. Клетки К. pneumoniae обрабатывают такой дозой мутагена, чтобы выживаемость составила примерно 0,1—1,0%. Некоторые из мутантных клеток, способные расти на минимальной среде, содержащей источник связанного азота типа NH₄C1, но не в отсутствие связанного азота, вероятно, несут мутацию в nif-гене; их обозначают Nif ^--.

2. Используя экспрессирующие плазмидные векторы с широким кругом хозяев, создают банк клонов хромосомной ДНК К. pneumoniae дикого типа (Nif⁺) и поддерживают его в Е. coli.

3. Проводят конъюгацию Nif^–-клеток К. pneumoniae с клетками E. coli, несущими банк клонов в плазмидных векторах.

4. Трансформированные клетки К. pneumoniae, приобретшие фенотип Nif⁺, отбирают, высевая их на минимальную среду, не содержащую источника связанного азота. В этих условиях растут только Nif^–-клетки К. pneumoniae с плазмидой, кодирующей белок, который отсутствует или не функционирует в Nif^–-мутанте.

Фрагмент ДНК в плазмиде, комплементирующий хромосомную мутацию Nif^–, содержит nif-ген, который можно детально охарактеризовать и использовать для выделения других nif-генов.

Для выделения других генов, участвующих в фиксации азота, применяли два подхода. Во-первых, использовали банк клонов К. pneumoniae для комплементации независимо возникающих Nif^–-мутантов, увеличивая тем самым вероятность того, что в каждом случае будет выделен другой nif-ген. Во-вторых, выделенные nif-гены использовали в качестве гибридизационных зондов для скрининга банка клонов хримосомной ДНК К. pneumoniae, несущих большие вставки (от 7 до Шт. п. н.), исходя из того, что у прокариот гены одного пути биосинтеза обычно образуют кластеры.

В результате всесторонних исследований был идентифицирован и охарактеризован весь набор nif-генов К. pneumoniae. Эти гены организованы в один кластер длиной примерно 24 т. п. н. (рис. 14.4), который содержит семь отдельных оперонов, колирующих в общей сложности 20 разных белков (табл. 14.2). Для того чтобы образовалась активная нитрогеназа, все nif-гены

Таблица 14.2. Гены К. pneumonias, участвующие в фиксации азота, и кодируемые ими белки (или функции)
nif- Ген	Белок (функция)

Бактерии, стимулирующие рост растений 311

Рнс. 14.3. Выделение nif-генов методом генетической комплементации. Для комплементации Nif ~-штамма К. pneumoniae используется банк клонов ДНК Nif+-клеток. Трансформированные клетки отбирают по их способности расти на минимальной среде, не содержащей связанного азота.