ГЛАВА 14.

Рис. 14.4. Расположение nif-генов в кластере и некоторые кодируемые ими функции. Гены обозначены заглавными буквами; красная стрелка под каждой из групп этих букв обозначает специфический nif-оперон и указывает направление его транскрипции. Стрелки, отходящие от обозначений генов, показывают, какое участие в фиксации азота принимают продукты некоторых из этих генов. F — флаводоксин, FO — пируват : флаводоксин окcидоредуктаза.

должны транскрибироваться и транслироваться одновременно (под регуляторным контролем nifA- и nifL-генов). Белок NifA — это активатор транскрипции всех nif-оперонов, кроме своего собственного. Он связывается со специфической последовательностью ДНК (5'-TGT-N₁₀-ACA-3'), которая находится в каждом промоторе каждого nif-оперона. Сайт связывания белка NifA находится примерно в 80—150 нуклеотидах перед каждым сайтом инициации транскрипции. Перед началом транскрипции с nif-промотора связавшийся с ДНК белок NifA взаимодействует со специфическим белком инициации транскрипции σ⁵⁴. Белок NifL — репрессор. В присутствии либо кислорода, либо связанного азота он действует как антагонист NifA и в результате ингибирует транскрипцию всех других rtif-генов.

Роль К. pneumoniae в общем биологическом процессе связывания азота не является основной. Поэтому в целях модификации процесса фиксации азота почвенными бактериями, представляющими большой интерес с точки зрения стимуляции роста растений, были кло-

Бактерии, стимулирующиерост растений 313

нированы и охарактеризованы nif-гены из других источников. При этом nif-гены К. pneumoni· ае использовались в качестве гибридизационных зондов для выделения соответствующих генов из банков клонов других диазотрофных микроорганизмов. Большннство диазотрофов имеет сходный набор генов, кодирующих аппарат фиксации азота, и последовательности ДНК этих генов у разных организмов мало различаются.

Принимая во внимание результаты молекулярно-генетических исследований, вероятно, можно повысить уровень фиксации азота диазотрофными бактериями, модифицируя nifA- и nifL-гены. После введения с помощью методов генной инженерии дополнительных копий nifA-гена в штамм Rhizobium meliloti растения люцерны, зараженные этим рекомбинантным штаммом, достигали больших размеров и давали больше биомассы, чем растения, обработанные нетрансформированным штаммом. По-видимому, аналогичным образом можно поступить с nifL-геном, так чтобы белок NifL (негативный регуляторный фактор) стал бы менее чувствительным к присутствию связанного азота. При таком нарушении регуляции микроорганизм поставлял бы больше азота своему симбиотическому партнеру. Однако имеющиеся данные указывают на то, что не все азотфиксирующие организмы синтезируют белок NifL (y некоторых из них существенные области NifL могут быть составной частью NifA), так что подобный подход не является универсальным. Кроме того, увеличение количества азота, которое может фиксировать микроорганизм, приводит к увеличению количества энергии (обычно в форме связанного углерода), необходимой для обеспечения метаболизма. Следовательно, рекомби-нантный микроорганизм может оказаться неспособным стимулировать рост растения просто вследствие замедления своего роста.

Имея в виду всю сложность процесса фиксации азота микроорганизмами, можно сделать вывод, что простого введения в недиазотроф-ную клетку-реципиент одного или двух nif-генов недостаточно для того, чтобы она приобрела способность связывать азот. Более того, даже введение в геном растений полного кластера nif-генов длиной 24 т, п. н. не даст необходимого эффекта, поскольку при той концентрации кислорода, которая характерна для растительной клетки, нитрогеназа инактивируется. Если же концентрацию кислорода понизить, то растительная клетка вероятнее всего погибнет. Но в первую очередь попытки создания растительных клеток, способных связывать азот, требуют решения фундаментальных проблем транскрипции, трансляции и регуляции. Например, трудно представить, как будет осуществляться регуляция фиксации, поскольку у растений нет промоторов, с которыми связывался бы белок NifA. Следовательно, в таком трансгенном растении транскрипция nif-генов не будет инициироваться. Кроме того, чтобы реагировать на уровень связанного азота в клетке, все nif-гены должны находиться под контролем отдельных промоторов, поскольку растительные клетки неспособны процессировать мультигенные транскрипты. Учитывая все сказанное выше, приходится констатировать, что создание растений, способных фиксировать азот, вряд ли возможно.

Гидрогеназа

Нежелательная побочная реакиия фиксации азота — восстановление нитрогеназой Н⁺ до Н₂ (газообразный водород), в ходе которой энергия (в форме АТР) расходуется на образование водорода, который в конечном счете просто улетучивается. В результате только от 40 до 60% всего потока электронов, проходящих через нитрогеназный комплекс, передается на N₂, что значительно уменьшает эффективность процесса фиксации азота, В принципе, если бы Н₂ мог превратиться обратно в Н⁺, потери энергии были бы ниже, и процесс фиксации азота стал бы более эффективным. Устранить же эту побочную реакцию прямым путем невозможно, поскольку она обусловлена особенностями химического строения активного центра нитрогеназы, и если попытаться блокировать ее, изменив структуру фермента, то неизбежно произойдет и уменьшение активности нитрогеназы.

Метаболизм водорода

Всередине 1970-х годов было показано, что некоторые штаммы Bradyrhizobium japonicum могут расти в микроаэрофильных условиях (при

314 ГЛАВА 14

Рис. 14.5. Рециркуляция газообразного водорода - побочного продукта фиксации азота. Нитрогеназа катализирует образование водорода, используя энергию гидролиза АТР, а гидрогеназа катализирует его утилизацию.

низкой концентрации кислорода), используя в качестве источника энергии водород. Для этого они синтезируют фермент гидрогеназу, способную превращать атмосферный Н₂ в Н⁺ (рис. 14.5). Чтобы проверить, можно ли с помощью этих штаммов влиять на рост сои, растения инфицировали В. japonicutn, синтезирующими гидрогеназу (Нuр⁺). Растения давали большую биомассу и усваивали больше азота, чем те, которые были заражены Ηuρ^~-штаммами, даже несмотря на более высокий уровень нитрогеназной активности последних (табл. 14.3). По результатам этого и аналогичных экспериментов был сделан вывод, что наличие системы ассимиляции водорода у симбиотических диазотрофов типа В. japonicum повышает их способность стимулировать рост растений, по-видимому, в результате связывания и рециркуляции газообразного водорода, образующегося в клубеньках при участии нит-рогеназы (рис. 14.5).

Несмотря на выгоды, которые получает растение от симбиоза с диазотрофным микроорганизмом, обладающим системой повторного использования водорода, в природных условиях такая система при участии штаммов Rhizobium встречается редко. Согласно результатам тестирования, представленным в табл. 14,4, большинство рассмотренных природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium имеют фенотип Hup^~. Было проверено по несколько штаммов каждого из указанных видов, а для В. japonicum их было более 1400. Ясно, что как только удастся достаточно подробно изучить генетическую природу гидрогеназной системы и идентифицировать соответствующие гены, коммерческие Нир~-штаммы Rhizobium будут первыми кандидатами на превращение в штаммы с фенотипом Нир⁺.

Модификация генов гидрогеназ

На изучение гидрогеназ как диазотрофных, так и недиазотрофных микроорганизмов в послед-

Таблица 14.3. Относительная активность нитрогеназы и гидрогеназы и способность В. japonicum Hup+ (SR) и трех Hup~ -мутантов (SRI, SR2 и SR3) стимулировать рост растений1) 2)
Штамм В, japonicum	Относительная активность нитрогеназы	Относительная активность гидрогеназы	Относительная сухая масса растения	Относительное содержание азота
" Из работы Albrecht et al. Science 203: 1255-1257, 1979.
г> Активность нитрогеназы оценивали по зависимости количества ацетилена, восстановленного до этилена, от времени; активность гидрогеназы определяли при помощи водородного электрода. Сухая масса растения включает массу листьев и корней. Содержание азота рассчитывали как долю сухой массы, приходящуюся на азот. Все величины нормированы относительно таковых для родительского штамма.

Бактерии, стимулирующие рост растений 315

Таблица 14.4. Доля природных штаммов Rhizobium и Bradyrhizobium, у которых есть система ассимиляции водорода (Hup+) 1)

Бактерия Штаммы Ηuρ+, %

1) Из работы Evans et al. Anna. Rev. Mlcrobiol. 41: 335-361, 1987.

ние 20 лет было затрачено много усилий, и тем не менее строение и функции этих ферментов до конца не установлены. Многие микроорганизмы синтезируют более одной гидрогеназы, при этом часто они состоят больше чем из одной полипептидной цепи. Одни гидрогеназы только связывают атмосферный водород, в то время как другие при соответствующих условиях могут также синтезировать его. Из всего этого следует, что вряд ли для преобразования штамма Hup~ Rhizobium в Нир⁺ будет достаточно простого включения в его геном гена одной из гидрогеназ. Включенный ген(ы) должен кодировать все субъединицы фермента. который должен быть совместим с электронтранспортной системой организма-хозяина.

Наиболее распространенная стратегия выделения генов гидрогеназ — генетическая комплементация. Первый из таких генов, ген мембраносвязанной гидрогеназы Е. colt, был идентифицирован методом комплементации у мутантной Е. coli, неспособной синтезировать активную гидрогеназу, с использованием банка клонов ДНК Е. coli дикого типа, созданного с помощью плазмиды pBR322. Мутант, содержащий дефектную мембраносвязанную гидрогеназу, не рос на минимальной среде в присутствии формиата, при этом активность эндоплазматической гидрогеназы оставалась неизменной. Трансформированные клетки, способные расти на такой среде, проверяли на присутствие в них активной гидрогеназы. Трансформант, у которого активность гидрогеназы восстановилась до такого же уровня, как у штамма дикого типа, содержал плазмиду, кодирующую белок мол. массой примерно 60 000 Да, что соответствует мол. массе одной из субъединиц мембраносвязанной гидрогеназы E. coli. Дальнейшие исследования показали, что в гидрогеназную систему E. coli входит множество генов.

Затем были идентифицированы гидрогеназные гены (hup) B. japonicum;для этого использовался банкклонон ДНК. дикого типа, созданный с помощью космидного вектора pLAFRl с широким кругом хозяев, и мутанты Hup^~ B. japonicum. Присутствие гидрогеназы, связывающей атмосферный водород, в трансформированных мутантных клетках Нир^~ определяли по способности активного фермента восстанавливать ме-тиленовый синий в атмосфере водорода. Более детальное исследование показало, что hup-гены В. japonicum образуют по крайней мере два, а возможно, и три оперона, охватывающих примерно 15 т.п.н., причем hup-гены Rhizobium leguminosarum аналогичны таковым В. japonicum как в отношении нуклеотидной последовательности, так и в том, что касается организации генов. Таким образом, идентифицированные hup-гены В. japonicum можо использовать в качестве гибридизационных зондов для поиска гомологичных генов из банка клонов R. leguminosarutn.

После идентификации Лир-генов R. ieguminosarum, несмотря на всю сложность гидрогеназной системы, удалось «переместить» ее из Hup⁺-штамма Л. leguminosarum в штамм Нир^~ (табл. 14.5). Растения бобов, на которых образовывали клубеньки бактерии рекомбинантного Hup⁺-штамма R. leguminosarum, росли быстрее и содержали больше азота, чем растения, инокулированные Нир^~-штаммом (табл. 14.5).

Работы по исследованию генов гидрогеназ не вызвали столь большого интереса, как исследования nif-генов, и тем не менее они убедительно продемонстрировали целесообразность применения методов генной инженерии для повышения способности диазотрофных микроорганизмов стимулировать рост растений. Теперь нужно проверить, приведет ли введение hup-генов в геномы других диазотрофных микроорганизмов (как несимбиотических, так и симбиотических) к такому же эффекту.

Гидрогеназная система может применяться не только для повышения эффективности фиксации азота. Так, очищенную гидрогеназу можно использовать для преобразования и запаса-