Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника



Гельді биочиптер

Читайте также:
  1. Ай ойшыл Гегельдің философиясын сынға алған: Фейербах
  2. ДНҚ биочиптері

 

Биочиптер– биологиялық материалдың көп микросынақтарды параллельді анализдерді жүргізу үшін секциялық (ұяшықтардан тұрады) матрицадағы сенсорлар (биосенсорлар) тобы.

1989 жылы Энгельгард атындағы РҒА микробиология Институты ғалымдары «Нью-Йорк таймс» ХХІ ғасырдың жоғары технологиялар дамуына максималды ықпал тигізген ғалымдар ішінде үшінші орындағы, адам геномын зерттеуінің Халықаралық ұйымның вице-президенті, А.Д. Мирзабековтің жетекшілігімен дүние жүзінде бірінші болып ДНҚ-чип туралы мақала шығарды.

Биочиптер адамның аурулар диагностикасының жаңа технологиясы ретінде негізінен «бұрыңғы» жақсы белгілі азотты негіздердің комплементарлық принципі (ДНҚ-чиптер) немесе антиген мен антидененің қарым-қатынас механизмі бойынша (нәруыздық чиптер), немесе фермент(тер)тің субстратпен дара немесе клетка құрамындағы арнайы реакцияларына (ферментті және клеткалық сенсорлар) негізделген. ДНҚ бір молекуласымен, бір ғана спецификасы бар антиденемен немесе бір ферментпен орындалатын ПТР, ИФА және фермент-субстратты реакциялардан биочиптері бар диагностикалық тесттердің айырмашылығы – олар бір мезгілде жүздеген және мыңдаған олигонуклеотидтер молекулаларымен жүргізілетін реакциялар сериясы, осындай микрореакциялар көлемі 20 микрон ұяшықтарда өтеді (биочип бетінде осындай ұяшықтар жүзден бірнеше мыңға дейін болуы мүмкін). Комплементарлы олигонуклеотидтердің гибридизациясы, антиген-антидене комплексі түзілуі, субстрат пен ферменттер байланысының биохимиялық реакциялар қорытындыларын флюоресцентті таңбалау, электростаттық шығару (тебу) күшін, электроток өткізштігін, масс-спектрометрия (зонд затының молекулалық массасы жоғарлауы бойынша) және т.б. көмегімен анықталынады. Осы мақсатта арнайы автоматтандырылған анализаторлар – биочип-детекторлар ойластырылған.



Биочиптер - бұл тани алатын немесе биологиялық активтілік көрсететін зонд-молекуласы бар қандай да болмасын тығыз калып. Биочиптер диагностикалық медицинаның міндетті құралы болды, гендер эксрпессиясы мен гендік полиморфизм зерттеуінде қолданыс тапты; бұл технология адам денсаулығына қоршаған орта факторлар әсерін анықтауына, организмге жана дәрілер әсерін зерттеуге мүмкіндік берді.

Биочип-анализ технологиясы инженерлік дайындығы тұрғыдан өндірісте кең қолданыска ие болған электронды микросхемалар, электронды платоларға тен. Замануи инженерлік техника көлемі бірнеше сантиметр құрайтын талдаушы матрица (ұяшықтары бар биочип калыптары) дайындауға мүмкіндік береді.

Биочип технологиялардың пайда болуы мамандырылған аппараттық, алгоритимдік және бағдарламалық құралдарды өндіру қорытындысына байланысты. Сонымен катар, бұл молекулалық биологтар, физиктер, химиктер, математиктер, программистер, микроэлектроника мамандары және т.б. әр сала мамандарының қарым-қатынас ынтымақтастығының жетістіктері.



Медициналық диагностикада биочиптерді аса қолданысқа ие болуы және одан әрі келешекте қолданудың негізгі себептері, олардың жоғары сезімталдығы, ерекшеліктігі және жылдам құрастыруы, орындау процедуралары женіл, бір уақытта көптеген зерттеулер және параметрлерді анықтап жұмыс құны арзаң болуымен түсіндіріледі.Сауда рыногындағы биочиптердің 90% олигонуклеотидті чиптер құрайды (көптеген жұқпалы, тұқымкуалайтын және онкологиялық аурулардың диагностикасында қолданылады), ал қалғандарын протеинді чиптер үлесінде.Осындай үлестірілудің себебі, ақуыздар жұмыс барысында инактивацияланады, талғамдылығын және биологиялық белсенділігін жояды, қазіргі уақытта олармен жұмыс істеу әдістемесі киындықтар тудырып отыр.

Биомедициналық және фармакологиялық зерттеулерде танып алатын биоэлемент ретінде олигонуклеотидті, ақуызды (антиденелер немесе ферменттер негізінде) және клекалық биочиптер қолданылады.

Орындау техникасы бойынша биочиптердің негізгі екі типін ажыратады:

- беткейлік биочиптер, селекцияланған биоматериал тікелей матрица бетіне (шыны, пластик және т.б.) иммобилизацияланады;

- гельді биочиптер, селекцияланған материалдың биомолекулалары гель көлемінде, матрица құрамында біркелкі орналасып иммобилизацияланады.

Биочиптердің негізгі элементтері ұяшықтар матрицасы (көлемі 10-нан 100 микронға дейін), әр кайсысында көптеген биологиялық молекулалардың немесе олардың фрагменттерінің тек біреуіне талғамдылығы бар молекулалық зонд (мысалы, ДНҚ қатарына, протеинге).Осындай зонд ретінде олигонуклеотидтер, геномды ДНҚ фрагменттері, протеиндер, антиденелердің вариабельді доменнің фрагменттері және т.б. қолданылады.

Беткейлік матрицалық биочиптерге молекулалық зондыларды мембраналар бетіне немесе шыны, пластик және т.б. дайындалған пластинаға иммобилизациялайды. Гельді биочиптерде зандыны арнайы өнделген шыны бетіне шамамен 20 микрон қалындығы бар полиакриламидті гель қабатына немесе диаметрі 100 микрон жартылай сфералы гидрогельді шыныларға иммобилизациялайды.

Беткейлік және гельді биочиптерде тексерілетін молекулалар ерітіндіден шыныларға диффузиясы арқылы комплекстер түзілуімен гибридизация жүреді. Ескеру керек, диффузия бәсендеп жүретін процесс болғандықтан, гибридизация кинетикасын жылдамдату үшін биочип бетіне көлденең электр желісін тартады немесе перистальтикалық насостар, беткейлік акустикалық толқындар және т.б. көмегімен гидродинамикалық үздіксіз тасқындар индуцирлейді.

 

Гелді биочиптер бұл химиялық байланыспен шыны, пластик немесе силикон бетіне химиялық байланыспен бекітілген жартылай гидрогель тамшысы. Селекциялайтын биомолекулалар бір келкі орнықтырылады және гель көлемінде химиялық байланыспен иммобилизациялайды. Екі кеңістікті жазық бетіне қарағанда, гель көлемінде үш кеңістікті жазықта иммобилизация жүргізудің бір қатар жетістіктері бар (сурет 15).

Сынаманың молекулалары зондтың молекулалары екі кеңістікті чип үш қеністікті биочип

Сурет 15. Екі жазықты беткейлік және үш кеңістікті гельді биочиптер

Биочип сыйымдылығы беткейінің бірлігіне қарасты оңдаған және жүздеген есе жоғарлайды және оған қоса өлшем сезімталдығы да күшейеді. Иммобилизацияланған макромолекулалар гомогенді сулы ортада бекітілген, гель көлемінен шамамен 95% құрайды. Бұл олардың бір-бірімен және тығыз беткейімен қарым-қатынасын болдырмайды, онда жабысқан биомолекулалар қатысуымен өтетін гетерофазалық процестер аса қиыншылықпен өтеді. Бұл процесс нәруыздық биочиптерге маңызды, себебі сулы орта мен тығыз беткей арасында пайда болған нәруыздар молекулалары интерфазада денатурацияға ұшырау тенденциясы бар. Сонымен, гельдік элементтер ауада немесе майдың астында жеке микро- және нанолитрлі пробиркаларға ауысады, әр қайсысында жеке түрлі арнайы байланыстар, химиялық және ферментативті реакциялар жүргізеді. Биочипте жүргізілген процестерді тіркеуі флюоресцентті және кей жағдайларда хемилюминесцентті және масс-спектрометриялық әдістер көмегімен атқарылады (сур.16).

Гельді биочиптерді дайындау технологиясы аса универсальды және табигаты әртүрлі иммобилизацияланған зондылары (ДНҚ, РНҚ, антиденелер, ферменттер және т.б.) бар чиптер өндірісіне қолдануы мүмкін.

 

1. зерттелетін материалға флуоресцентті таңба енгізіледі

2. Таңбаланған материалды биочип ұяшықтарына енгізіледі

3. Таңбаланған материал биочип ұяшықтарында матрицамен байланысады

 

Зерттелетін материалда нысана молекуласы жоқ Зерттелетін материалда нысана молекуласы бар

Ұяшықтарда сигнал жок ұяшықтарда сигнал бар

 

Сурет 16. Сынақтың флуоресцентті детекциясы

РҒА МБИ дайындаған гельді биочиптердін негізгі сатылары (сур.17): - бірінші сатысында (I) анализде зонд болатын биологиялық активті қосылыстар мен гидрогель қалыптасуына мономерлерден құралған композициялар дайындалынады. Осы композицияларды дозатор көмегімен микротитрлеу планшетаға салады;

 

микротитрлеу планшет автоматты микродозатор ультракулгін сәулесі чиптегі биоматериалдын микротамшылары

Сурет 17. РҒА ИМБ-да гельді биочиптерді дайындау технологиясы

 

- екінші сатысында автоматты микродозатор (робот) көмегімен микротитрлеу планшетадан композицияны флюоресцентті емес жазық қалыпқа (шыны, пластик, металл және т.б.) микротамшы төмпешік ретінде ауыстырылады. Гидрогельді иммобилизациялау үшін қалып ретінде шыны бетінде жүйелі емес метакрильді топты құрайтын арнайы реагенттермен өнделген шыны пластиналар алынады. Әрі қарай осылай активтендірілген шыныға енгізудің пиндік технологиясымен робот гель түзетін мономерлер мен иммобилизациялайтын зондысы бар полимеризациялайтын қоспаны микротамшы ретінде тамызады. Шұнқырлар белгілі мерзімді қалыптың гидрофобты бетінде болады; микрочипте шұнқырлар саны әртүрлі;

- үшінші сатысында (III) фотополимеризация процесін инициирлеу үшін микротамшы төпшешіктерді ультра-күлгін сәулесімен әсер етеді. Зондының ковалентті иммобилизациясы микрочипті ультракүлгін сәулесімен сәулендіреді және гелсіз негізде лазер сәулесі көмегімен қалыптың бетіне зондыны (олигонуклеотидті) бекіту технологиясында қолдануға болады (сур.18).

 

Сурет 18. Иммобилизация үшін гельдегі зондының микротамшысын арнайы «сүзгі» арқылы ультракүлгін сәулемен сәулендіреді (сәулелер полимеризацияға ұшырайды, гельдік биочип шұнқырларына зондыны бекітеді), немесе зондыны лазермен бекітеді (беткейлік биочиптер).

 

Иммобилизация бір мезгілде гельдің полимеризациясымен бірге өтеді, яғни фотоиндуцирленетін полимеризация барысында өсіп жатқан полимерлі тізбек компоненттерін зондыға ковалентті байланыспен біріктіреді. Фотоиндуцирлеуші полимеризация реакциясына қатысу үшін бифункциональды гель түзуші мономерлермен (кросс-линкерлермен) алмастыру немесе қосылу реакцияларына қатысуға қабілетті биологиялық қосылыстардың активті топтары болуға тиісті. Осындай активті топтар ретінде амино- және сульфгидрильді топтар қатысады. Нәруыздар секілді биологиялық қосылыстар қосымша модификацияны қажет етпейді, ал олигонуклеотидтерді, ДНҚ және қанттарды иммобилизация алдында олардың құрылымына міндетті түрде амино- немесе сульфгидрильді топтар енгізу арқылы модификация жасалынады;

- cызбанұсқада көрсетілген сатылардан кейін биочиптер тағы да «шаю» және «сапасын тексеру» сатыларын өтеді. «Шаю» сатысында құралған биочиптің гидрогелді элементерінен реакцияға қатыспаған компоненттер және гидрогель пайда болған ерітінді шайылып кетеді. Сапасын бақылау ЭВМ қосылған, арнайы бағдарламамен қамтылған, ССД-камерасы бар портативті кеңкөлемді флюоресцентті микроскоп көмегімен атқарылады. Бағдарламалық жабдығы биочип элементтерін тани алады, олардың параметрлерін өлшейді (иммобилизацияланған биологиялық активті қосындылар диаметрі, көлемі және саны) және статистикалық өндеу жүргізіп нақты сұранысқа чиптің жарамдылығы туралы ақпарат береді. Осындай биочип форматын үшкеңістікті (гелді) чиптерге жатқызады, екікеңістікті (беткейлік) чиптермен салыстырғанда.

 

Гельді биочипті қолдану технологиясы

Аффинді биочиптер технологиясы қолданыста универсальды, селекциялайтын материал ретінде әртүрлі спецификасы бар моноклонды антиденелер қолданылады, олар антигенділігі және спецификасы бар түрлі нәруыздармен байланысуға қабілетті (патогенді вирустар, бактериялар, атипті клеткалар, токсиндер және т.б.). Осындай биочип жұмысының принципі антиген-антидененің спецификалық қарым-қатынасы реакциясына негізделген, бірақ микрокөлемде, микромасштабта. Мысалы, гельді биочип құрамында тексерілетін материалда қажетті антигенді тани алатын түрлі спецификасы бар иммобилизацияланған моноклонды антиденелер бар. Патогенді бактериялар, вирустар, атипті клеткалары бар тексерілетін материалды шұнқырларға енгізгенде антигеннің комплементарлы антиденесімен байланысуының иммундық реакциясы нәтижесінде антиген-антидене комплексі түзіледі. Әрі қарай осы комплексті визуализациялау үшін антивидті антиденелермен коньюгирленген флюоресцентті таңбаны гельге салады, нәтижесінде алғашында түзілген антиген-антидене комплексімен байланысып қалыпта қалады (тура емес иммунофлюоресценция реакциясы). Реакция қорытындысын компьютермен басқарылатын чип-детектор деп аталатын автоматты анализатор тіркейді. Нақты белгілі ұзындықпен сәуле толқынымен сәулелендіруінде флюоресцентті таңбасы бекіген гидрогель шұнқыры жарық бере бастайды. Арнайы компьютерлік бағдарлама биочиптің шұңқырларында жарықтанудың үлестірілуін талдауда тексерілген материалда патогендер, атипті клеткалар бар ма не жоқ па деген сұраққа жауап береді. Зертханалық практикада бір-екі жүзді микрошұнқырлары бар биочиптен төрт мыңдай микрошұнқырлары бар қуатты қондырғылар қолданылады.

Антиген-антидене өзара қарым-қатынасы фермент пен субстрат арасындағы байланыста болатын табиғи күштер қажет: вандерваальсті күштер, иондық, гидрофобты және гидрофильді байланыстар, сутекті байланыстар. Биочипте антиденелерді қолдануы қиындықтар тудырады, себебі антиген-антидене комплексін тіркеу үшін визуализация керек. Бұл аффинді биочиптердің жалпы кемшілігі және арнайы әдістерді қажет етеді, мысалы флюоресцентті таңбаларды қолдануды. Келесі қиындығы аффинді қарым-қатынастардың ассоциация константтары тым жоғары болып келеді, яғни қайтымдылығы әлсіз, биочипте олар жиі бір реттік немесе арнайы регенерация әдістерін талап етеді.


Дата добавления: 2015-04-16; просмотров: 34; Нарушение авторских прав


<== предыдущая лекция | следующая лекция ==>
Биосенсор әсер етуінің принципиалды сызбанұсқасы | ДНҚ биочиптері
lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2019 год. (0.011 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты