Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника



ДНҚ биочиптері




Читайте также:
  1. ДНҚ – диагностикасы
  2. ДНҚ-ның 1-, 2-, 3-, 4-лік құрылысы. ДНҚ-ның биологиялық функциясындағы комплементарлық әсерлердің ролі.

ДНҚ биочиптері – ағылшын тілінде аталуы DNA – microarrays, шыныдан, полимерлерден, гельден (полиакриламид) немесе пластикадан дайындаған арнайы қалыпта, пластина-платформасында ұйымдастырылып орналасқан ДНҚ молекулалары. Кей жағдайда басқа материалдар да қолданады, мысалы электронды микросхемаларға салатын кремнийді. ДНҚ биоматериал ретінде шұнқырда гидрогельмен (гельді биочиптер) немесе чиптің тығыз қалыпында иммобилизацияланған (беткейлік биочиптер) болуы мүмкін. ДНҚ молекуласын иммобилизациялау үшін қалыптың бетін арнайы реактивтермен – органотриалкоксиланмен, глицидилоксисиланмен және т.б. өнделінеді. Осылай өнделу барысында беткейлік атомдар мен модификацияланған реагентер арасында силоксанды көпір пайда болады, нәтижесінде олигонуклеотидтердің иммобилизациясына қажетті немесе «аяқтың» бірнеше сатыдан кейін қалыптасуы олигонуклеотидтердің үлкен конформациялық бостандығын қамтамасыз ететін қалыптың бетінде көп санды функциональды топтар (негізінен, амин топтары) құрайды. Робот көмегімен ДНҚ бір жіпті фрагменттері – олигонуклеотидтер (қысқалары – 15-60 нуклеотидтер және ұзындары – 100-3000 нуклеотидтер) иммобилизацияланады (негізінен, ковалентті), (сур.19). Сондықтан биочиптерді олигонуклеотидті және ДНҚ-ды беткейлік түрлеріне бөледі. Платформада ұйымдастырылып орналасқан ДНҚ пошта маркасынан визитті карточкадай жерде орналастырады. Биочиптің микроскопиялық көлемінде тексерілетін материалдың комплементарлы нуклеин қышқылдар жіптерімен байланысу қабілеті бар оңдаған және жүздеген мың түрлі олигонуклеотидтер, ДНҚ фрагменттер орналастыруға болады.

Осылай дайындаған ДНҚ-биочипті бояумен таңбаланған зерттелетін ДНҚ молекуласымен гибридизация жасайды және оқуға арналған флюоресцентті микроскоп немесе арнайы лазерлі қондырғымен шұнқырлардағы ақпаратты оқып шығарады. ДНҚ-биочиптері кеңінен таралған және шыны қалыпында орналасады.



Ферменттік реакциялар жүретін шұнқырлар нәруыздық чипте сирек ара қашықта орналасады.

Сурет 19. Биочиптерді дайындау үшін микросхемаларды дайындауға ең алдымен микроэлектроникада жұмыс істейтін роботтарды қолданады. Автоматтандырылған режимде шыны қалыпқа нақты олигонуклеотиді немесе кДНҚ орналасатын жеріне биоматериалды өте аз мөлшерде енгізу. Биоматериалдың иммобилизациясына беткейінде нуклеин қышқылы бар шыныны ультракүлгінмен өндейді, нәтижесінде шыны мен ДНҚ молекуласы арасында химиялық байланыс пайда болуы белсенеді (РҒА МБИ).

ДНҚ-биочипті қолдану сызбанұсқасы:

1) талдау материалынан бөліп алынған гибридті (зерттелетін) ДНҚ алдымен ПТР көмегімен көп көлемде жинайды. Жетілдірген модельдерде гибридизация жасайтын ассимЕтриялық мультипраймерлі ПТР-амплификация бірден биочип шұнқырларында өтеді. Сонымен қатар, осы чипте ДНҚ фрагментациясы, фосфорилдену, лигирленуі жүреді. Зерттелетін ДНҚ амплификациядан кейін рестриктаза-ферментерімен белгілі фрагменттерге бөлінеді де флуоресцентті таңбасы бар фрагменттерді коньюгациялауына алғашқы өнделуден өтеді. Тексерілетін ДНҚ құрылымды бөліктері болып келетін көптеген санды таңбаланған олигонуклеотидтер жинағы пайда болады;



2) диагностикалық белгілі олигонуклеотидтері бар биочиптің гельдік микрошұнқырларына тексерілетін (гибридизацияланатын) ДНҚ микротамшысы тамызылады;

3) шыныда біржіпті олигонуклеотидтерді енгізіп тексерілетін нуклеин қышқылдарының гибридизациясы жүреді. ДНҚ комплементарлы жіптерінің гибридизация процесі жүруіне чипті түнге термостатқа инкубация жасайды. Егер тексерілетін сынамада олигонуклеотид шұңқырға бекітілгенге комплементарлы болған жағдайда олардың арасында байланыс орнығады, ортаны шайғанда олар қалып қояды, ал байланыспаған олигонуклеотидтер шайылып кетеді;

4) арнайы компьютерлі бағдарламалар қолданатын анализаторлар көмегімен гибридизация қорытындыларына визуализация және шыққан суреттемеге талдау жасалынады (сур.20,21). Осы мақсатта шайып алған биочипті кептіреді де анализатор көмегімен шұнқырлардағы флуоресцентті жарықтанудың активтілігін анықтайды.



 

 

Сурет 20. РҒА МБИ дайындаған портативті флюоресцентті микроскопы бар биочиптер анализаторы

 

Диагностикалық биочип Зерттелетін материалды флюорохроммен белгілеу Биочиптер анализаторы

 

Сурет 21. Биочип -детекция

 

Кейін компьютерлік анализдің қорытындылары бойынша, осы шұнқырларға алдында енгізілген олигонуклеотидтерді білгендіктен және комплементарлы жұптардың бірлігін есептеу арқылы тексерілетін ДНҚ түрге, типке спецификасы белгіленеді. Тексерілетін сынамада ДНҚ минимальды концентрация шекарасы 10 аМ (10 -18м) тен болуы керек.

ДНҚ-микрочиптерді қолданып анализ қорытындыларын бағалаудың келесі әдісі зарядтары бірдей нысаналар арасында пайда болатын электростатты тебу күшін өлшеуіне негізделген. Осы мақсатта гибридизациядан кейін (флуоресцентті таңбасы жоқ зерттелетін ДНҚ сынағы) микрочип бетіне ұсақ электр қуатымен зарядталған кремний (шыны) шаралары бар сұйықтық тамызылады. Кейін микрочип бетіндегі шаралардың броун бойынша жылжуы анализге алынады және белгілі олигонуклеотидтермен микрочипте иммобилизацияланған белгілі олигонуклеотидтердің гибридизациясы жүрген ДНҚ молекуласы және зарядталған шаралар арасында электрлі тебу күшін өлшейді. Осындай өлшеулер бір мезгілде миллиондаған ДНҚ жүйелерін талдай алады. Осы технологияның сезімталдығы сынақтың флюоресцентті таңбалауынан кем емес.

Сезінген зондыларды масс-спектрометриямен анықтауға болады (зерттелетін материалдың электр қуатын өткізу өзгерісі бойынша зонд затының молекулалық салмағы жоғарлауын өлшеу).

Биочип – бір рет қолданатын қондырғы емес, дұрыстап жуғаннан кейін қайтадан қолдануға болады. Сонымен қатар, биочиптерді аса сезімталды, жылдам сезініп дыбыс береді, қажетті градуировка жасауы жеңіл, қауіпті емес және тұрақты деген сипаппама беруге болады. Имплантатталатын биочиптердің маңызды мәселесі сенсорлы биомолекулаларының биосыйымдылығы және тұрақтылығы, яғни имплантаттың өмір сұру уақыты.

Нәруыздық биочиптер дайындау және қолдануы едәуір қиындықтар тудырады; нәруыздар жылдам инактивацияланады; осындай чиптердің принципі қандай да болмасын антигендерге (жиі инфекция қоздырғыштары) моноклонды антиденелерді иммобилиза-циялау, сонымен қатар гормондарды, аллергендерді және басқа да нәруыздарды иммо-билизация жасауға болады.

Келешекте биочиптер нанотехнологиялармен байланысып келесілер өнделінеді:

- lab-on-chip күрделі портативті қондырғыларды;

- имплантаттайтын биосенсоры;

- арзан толық геномды матрицалар.

 

Биочиптерді қолдану

1) Антибиотиктер әсеріне, әсіресе рифампицинге төзімді генетикасы өзгерген туберкулез микобактериясына диагностика жасайтын биочиптер өнделген (сур.22). Гельді биочип пластина шұнқырына зонд ретінде рифампицинге төзімді туберкулез микобактериясының бір спиральді ДНҚ қажетті фрагменті орнатылады. Әрі қарай тексерілетін микроорганизмнің ДНҚ сайт-спецификалы рестриктазалармен фрагменттерге ыдыратылады, оларды қажетті концентрацияға дейін амплификациялайды, кейін ДНҚ екі спиралін бір спиральға ширатады, осылай дайындаған ерітіндіні биочип бетіне енгізеді. Бұл жерде тексерілетін ДНҚ бір спиральді фрагменттері оларға комплементарлы гельге иммобилизацияланған олигонуклеотидті фрагменттермен гибридизацияланады. Нәтижелі қорытынды флюоресцентті таңбамен немесе басқа тәсілдермен детекцияланады.

 

 

 

Сурет 22. Биочип – туберкулездің диагностикасы

 

 

2) ДНҚ-биочипі көмегімен нақты жіті лейкоздың екі тип астысын (жіті миелоидты және жіті лимфобластты) диагностикалауға мүмкіндігі оларға дұрыс терапия тағайындауға қол жетті. Алғашында 6000 геннен құралған олигонуклеотидті биочип қолданылды. Сынақ ретінде сүйек кемігі клеткаларының РНҚ қолдана отырып зерттеушілер ұсақ чип ретінде 50 геннен құралған жинақты тапты, экспрессиясының аса күшті айырмашылықтарынан өспелер типін анықтауға жол ашты. Гибридизациядан кейін биочипте таң қаларлық өрнектер шығады.

Осындай өрнектер дені сау және обыр клеткаларында әртүрлі болып келеді немесе түрлі лейкоздарда ерекшелігі білінеді. Жазылатын лейкоздар түрінде бір өрнек шығады (паттерндер), ал жазылмайтында басқа паттерналар көрінеді. Биочипті қолданып генетикалық кодта тіршілік барысындағы мутациялардың диагностикасын жүргізуге болады. Мысалы, адам геномында дені сау, мутацияланбаған клеткаларда екі ген бір-бірінен ара қашықта орналасады. ДНҚ патологиялық ауыстырылу қорытындысында көрші болуы мүмкін, яғни лейкоздың басталғанын дәлелдейді;

3) Биочиптер ағзаларды ауыстырып салғанда, HLA-антигендер, гистосыйымдылықтың басты комплексінің нәруыздар сыйымдылығын анықтауға көп көмек береді. Трансплантат ажырамау үшін имплантацияланған тіндегі нәруыз-маркерлер пациенттің нәруыз-маркерлерінің айырмашылығы өте аз болу керек. Сондықтан тіндердің идеалды донорлары нәруыздық маркерлері бірдей болып келетін бір жұмыртқалы егіздерді есептейді. Дегенмен барлық адамдарда бір жұмыртқалы егіздері кездеспейді. ДНҚ-биочипті анализ көмегімен ағзаны ауыстырып салғанда минималды иммунды жауап беретін тиімді қажетті донорды іздеу іске асырылды.

4) Сыйымды донор қанын тандауға арналған ДНҚ-чип өндірісі тағайындалуда. Қазіргі уақытта қан тобы серологиялық әдіспен анықталынады, бірақ осы әдістің 3%-да қан тобы бойынша донор мен реципиенттің сыйымдылығы анықталмайды, нәтижесі реципиентте трансфузиядан кейінгі реакция оның денсаулығына қауіп төндіреді. ДНҚ-чипті анализдің жоғары сезімталдылығы осындай қателіктер жіберуге тиым салады; ДНҚ-чипті анализ сериялы және толығымен автоматтандырылған.

5) Биологиялық зерттеулерде биочиптер дәрілік препараттарға, биологиялық активті нәруыздарға, гормондарға және т.б. әртүрлі факторлардың әсерін бағалауға қолданатын оңдаған мың гендердің бір мезгілде скрининг жасауын қамтамасыз етеді.

 

 

4. Наномедицина


Дата добавления: 2015-04-16; просмотров: 26; Нарушение авторских прав







lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2021 год. (0.021 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты