Моноклональные антитела и технология гибридом

Первым этапом является иммунизация животного (например, белой мыши) тем антигеном, к которому необходимо получить моноклональные антитела. После развития иммунного ответа (что контролируется по появлению в сыворотке крови животного антител к выбранному антигену) из селезенки животного отбирают лимфоциты, смешивают с суспензией ГАТ-чувствительных миеломных клеток мыши, добавляют вещество, способствующее слиянию клеток (например, полиэтиленгликоль) и выдерживают необходимое для слияния время. Затем получившуюся смесь высевают на ГАТ-среду.

Поскольку слияние происходит неконтролируемо, в смеси могут содержаться: 1) не слившиеся В-лимфоциты из селезенки, 2) слившиеся друг с другом В-лимфоциты из селезенки, 3) не слившиеся миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 4) слившиеся друг с другом миеломные ГАТ-чувствительные В-лимфоциты, 5) гибридомы, являющиеся результатом слияния В-лимфоцитов из селезенки и миеломных ГАТ-чувствительных В-лимфоцитов. К размножению на ГАТ-среде оказываются способными только представители 5-й группы из присутствующих в смеси клеток, так как: первые две группы не дадут клонов из-за неспособности обычных, не раковых, клеток длительно размножаться in vitro, две вторые - в силу их чувствительности к ГАТ-среде. Зато в 5-й группе могут оказаться такие объединенные клетки, потомки которых унаследуют от миеломной клетки способность постоянно делиться, а от нормального, не ракового, В-лимфоцита -нечувствительность к ГАТ-среде.

Сформировавшиеся клоны проверяют на способность продуцировать антитела и отбирают те из них, которые дают антитела к использованному для иммунизации животного антигену. Часть клеток из каждого такого клона консервируют путем замораживания при температуре жидкого азота, а сам клон подвергают расчистке. Суть расчистки заключается в разделении клона на изолированные клетки, получении их потомства и анализе этого потомства на однородность и продукцию нужных антител. При необходимости проводят несколько последовательных расчисток получаемых дочерних клонов, причем на каждом этапе расчистки часть клеток каждого клона также консервируют, чтобы в случаях гибели клона была возможность не повторять процедуру с начала, а продолжить ее с конкретного этапа.

Полученные стабильные, не дающие расщепления клоны являются источниками гибридом, пригодных для получения абсолютно однород­ных по специфичности и изотипу антител, которые и называют монокло-нальными. Наработку нужного количества антител осуществляют либо побуждая гибридомные клетки к продукции антител в культуре, либо вводя суспензию таких гибридом в организм специально подготовлен­ных лабораторных животных.