Протопласты растительных клеток; способы получения, методы культивирования и регенерации.

Растительные протопласты - это ограниченные мембраной цитоплазматические образования, обладающие внутриклеточными органеллами и характеризующиеся структурной целостностью и способностью осуществлять активный метаболизм, а также реакции биосинтеза и трансформации энергии.

Впервые протопласты растительных клеток были получены при изучении плазмолиза (в 1892 г.) в клетках водного растения - телореза. Способ получения был весьма простым (если не сказать примитивным), но тем не менее с его помощью они были получены, а это главное, Тонкая полоска ткани растения видерживалась сначала в 0,1 М растворе сахарозы до тех пор, пока протопласт не "сожмется" и не отойдет от клеточных стенок, затем бритвой делался разрез полоски и протопласты высвобождались в среду. Такого рода методические приемы выделения протопластов получили название механических. Подобные методы имеют определенные ограничения: 1) с помощью их можно получить только небольшое количество протопластов; 2) можно использовать только те ткани, в клетках которых при данном способе может иметь место выраженный плазмолиз; 3) из зрелой ткани таким методом протопласты получаются с большим трудом; 4) метод довольно длительный и трудоемкий.

Принципиально отличающимся методом является ферментативный способ получения протопластов, при котором клеточная стенка удаляется с помощью ферментов. Таким методом уже в 1919 г. были получены протопласты клеток грибов в результате обработки их клеточных стенок желудочным соком улитки. В микробиологических экспериментах протопласты получались путем разрушения клеточных стенок бактерий лизоцимом. Изолирование протопластов растительных клеток с использованием ферментных препаратов было осуществлено в I960 г. (E.Cocking). По сравнению с механическими способами ферментативные методы получения протопластов имеют определенные преимущества: 1) можно одновременно получить большое количество протопластов; 2) формирующиеся протопласты не подвергаются сильному осмотическому сжатию; 3) клетки остаются менее поврежденными: 4) метод сравнительно быстрый.

Для удаления клеточной стенки при получении растительных протопластов используются ферментные препараты трех типов -целлюлазы, гемицеллюлазы и пектиназы. Действие этих ферментов состоит в деструкции основных компонентов клеточной стенки, обеспечивающих ее механическую прочность (ригидность). У растительных клеток этими компонентами являются целлюлоза, гемицеллюлоза и пектиновые вещества, которые находятся в клеточной стенке в различных соотношениях. Поэтому комбинации ферментных препаратов и их количественные соотношения должны эмпирически подбираться для кождого конкретного случая (т.е. в зависимости от вида растения, его возраста и органа, из которого берется материал для получения протопластов).

Иными словами, оптимальные условия для получения протопластов растительных клеток весьма индивидуальны для различных тканей и в каждом случае необходима предварительная работа по подбору состава ферментов, их концентраций и времени обработки. Формирующиеся протопласты должны находиться в контакте с ферментами минимальное время, после чего их необходимо тщательно отмыть. Ферменты, естественно, должны быть стерильными (стерилизация производится, как правило, путем фильтрования через бактериальные фильтры). Важным фактором является подбор осмотического стабилизатора.

Кроме осмотических свойств среды должны быть подобраны и другие условия. Например, протопласты чаще всего получают в темноте или при слабом освещении. Температурные условия могут варьировать в довольно широких пределах; стабильности протопластов в определенной степени способствуют высокие концентрации двухвалентных ионов, воздействующих на мембранные системы клетки.

Для культивирования протопластов используются два методических приема: инкубирование в каплях жидкой среды и помещение в агаровый слой. Естественно, что каждый из них имеет свои преимущества и свои недостатки.

В первом случае обеспечивается хороший обмен газами через воздушную фазу и легкая диффузия в раствор выделяемых продуктов обмена. Помимо этого, к растущим протопластам можно легко добавлять свежую питательную среду в желаемых концентрациях. Однако при этом способе протопласты имеют тенденцию агрегировать в центре капли, что препятствует наблюдению за судьбой индивидуальных колоний протопластов.

В соответствии со вторым методом определенный объем взвеси протопластов в жидкой среде добавляется к равному объему 1%-ной расплавленной и охлажденной агаризованной среды того же состава. После уплотнения (затвердевания) среды протопласты оказываются разобщенными друг от друга и фиксированными в одном положении, что обеспечивает наблюдение за развитием индивидуальных протопластов -формирование клеточной стенки, деление клеток и дальнейшие превращения. Недостатком метода является возможность механического повреждения протопластов при смешивании с агаром, а также температурные воздействия расплавленной среды при ее недостаточном охлаждении.

Само собой разумеется, что существуют различные модификации совершенствования описанных выше методов культивирования протопластов, изложение которых заняло бы много времени.

Удобным методом является культивирование протопластов в малом объеме жидкой питательной среды (до 1 мкл), метод получил название микроизоляции отдельных протопластов.

Очень важной проблемой клеточной инженерии растительных организмов является регенерация протопластов. Синтез клеточной стенки у образовавшихся протопластов практически начинается сразу после удаления раствора ферментов, вызвавших ее деструкцию, что можно относительно легко наблюдать с помощью флюоресцентного микроскопа.

Если регенерация клеточных стенок - процесс достаточно распространенный у протопластов, то добиться деления сформировавшихся из протопластов клеток значительно труднее, а еще труднее получение из них целых растений.

Возможность регенерации растений из протопластов является свидетельством их тотипотентности, как это в свое время было продемонстрировано для растительных клеток (P.Steward, 1970). Регенерация растений осуществляется либо посредством эмбриогенеза, либо в процессе развития каллуса с последующей индукцией морфогенеза, посредством подбора оптимальных уровней гормонов, стимулирующих соответствующие этапы эмбриогенеза или морфогенетического процесса. Короче говоря, имеется достаточно обширный арсенал методов культивирования клеток in vitro, с помощью которых можно с успехом выращивать протопласты и получать из них целые растения, что указывает на тотипотентность многих протопластов.