Методы поиска генов в банках генов и клонотеках.

Банк генов (gene bank) — набор генов данного организма, полученныйна основе рекомбинантных ДНК.

Библиотека генов (gene library) — коллекция произвольно клонированных фрагментов геномной ДНК организма или специальный набор фрагментов ДНК, представляющих, напр., коллекцию иРНК (см. РНК информационная, кДНК), экспрессирующуюся в клетке в

определенное время. В таких библиотеках фрагменты инсерцируются (включаются) в подходящие вектора, напр, космидные (см. Космида) или бакте-риальные векторы, и трансформируются (см. Трансформация) в подходящего хозяина. В идеале геномная библиотека должна содержать практически весь геном вида, из которого она происходит, а библиотека кДНК — все различные молекулы иРНК данной клетки на одной и той же стадии развития. Сейчас сконструировано множество типов генных библиотек для различных целей исследования.

Геномная библиотека (genomic library) — набор клонированных фрагментов ДНК, представляющих индивидуальный (видовой) геном. У млекопитающих (в т. ч. у человека)

геномы крупные, поэтому для них обычно создают хромосомные библиотеки .

Существует несколько методов скрининга, т. е. поиска в геномной библиотеке или в банке кДНК тех клонов (бактериальных или фаговых), которые содержат рекДНК с заданным геном. Из них основные — гибридизационный, иммунологический, генетический и рекомбинационный. Выбор метода во многом зависит от использованной системы клонирования. В случае клонирования эукариотической ДНК в клетках Е. сок единственным "паспортом" чужДНК служит ее нуклеотидная последовательность. Этот "паспорт" присутствует при всех способах клонирования, поэтому общий метод скрининга — гибридизация рекДНК с зондами, т. е. с нуклеотидными последовательностями (олигонуклеотидами, од-нонитевыми кДНК или мРНК), которые комплементарны отыскиваемому гену. На практике для этого пользуются методом гибридизации колоний (Gnmstein, Hogness, 1975). Если клонируемые гены экспрессируются (некоторые банки кДНК; клонированные в Е. coli геномные банки клеток кишечной группы, их фагов и плаз-мид), то для скрининга применяют иммунологические и другие методы, регистрирующие присутствие специфического белка.

Возможен направленный поиск в банке кДНК только тех генов, которые участвуют в определенном процессе, например, индуцируются действием какого-либо гормона. В этом методе, носящем название вычитательная гибридизация, сначала синтезируют первые нити кДНК суммарной мРНК, выделенной из индуцированных клеток. Затем образовавшуюся однонитевую кДНК гибридизуют с суммарной мРНК, выделенной из неинду-цированных клеток. Сформировавшиеся дуплексы мРНК:кДНК удаляют, а негибридизовавшиеся кДНК используют для синтеза двунитевых кДНК, которые и являются целью поиска (см. обзор Свердлов, 1993). Иммунологические методы. Эти методы применяют для выявления определенных клонов с рекДНК, если клонируемые гены экспрессируются. Напомним, что молекулы белков имеют по несколько антигенных детерминант (эпитопов), на каждый из которых в организме животных вырабатывается свое антитело (специфический иммуноглобулин). Сыворотки, получаемые стандартными методами, поликлональны, т. е. содержат антитела ко многим эпи-топам данного белка. возможен немедленный скрининг банка без его амплификации, для чего инфицированные бактерии высевают сразу на гибридизационные фильтры (см. с. 280). Банк кДНК. кДНК играют важную роль в исследованиях по молекулярной биологии эукариот. Они представляют собой гены без интронов, необходимые для экспрессии эукариотических генов в бактериях, а также для получения информации о кодирующей части гена (напомним, что кДНК не содержит регуляторных элементов генов). Анализ кДНК применяют для изучения клеток, по какой-либо причине меняющих активность своих генов. Зачастую кДНК служат также зондами. Например, если в геномном банке нужно найти методом гибридизации клон с заданным геном, а специфическая мРНК представлена в малом количестве, то сначала синтезируют кДНК, клонируют ее, метят и используют для скрининга.