Обоснование выбора и концентрации антител для включения их в состав конъюгата с наночастицами золота

В иммунодиагностике используются как моноклональные антитела, так и поликлональные. Моноклональные антитела обладают рядом преимуществ: полная стабилизация препарата антител, высокая специфичность, свободный выбор антигенных детерминант, к которым образуются антитела [54].

Наиболее важными характеристиками для выбора антител, входящих в состав конъюгата, являются: изотип, молекулярная масса, концентрация антител в буфере, вид буфера, в котором они находятся.

По данным литературы оптимальная концентрация для нанесения антител на рабочую нитроцеллюлозную мембрану в тестовую зону находится в диапазоне 0,5-3 мг×см^-3 [55]. Антивидовые антитела для формирования контрольной зоны наносят, как правило, в концентрации 1 мг×см^-3 [56, 57]. Внесение избыточного количества реагента приведет к увеличению несорбированных на поверхности молекул и к снижению аналитических характеристик производимой системы. Снижение же количества антител ниже указанного уровня в большинстве случаев недостаточно для эффективного специфического взаимодействия и формирования аналитической и контрольной зон высокой интенсивности, что снижает чувствительность иммунохроматографической системы [55].

Наилучшие результаты по чувствительности разрабатываемых тест-систем обеспечивает сукцинатно-боратный, либо трисовый буфер, однако наиболее длительное хранение антител обеспечивает фосфатный буфер. По-видимому, это объясняет, что большинство коммерческих антител выпускаются в фосфатном буфере. При приготовлении конъюгата и нанесении антител на нитроцеллюлозную мембрану для обеспечения более высокой чувствительности, по данным литературы, проводят предварительный диализ антител, находящихся в фосфатном буфере против сукцинатно-боратного, либо трисового буфера [18].

На аналитические свойства, разрабатываемой тест-системы влияет, как уже было сказано выше, изотип иммуноглобулинов. Наилучшими адсорбционными способностями для посадки на молекулу коллоидного золота и нитроцеллюлозную мембрану, а также по обеспечению специфического взаимодействия между антителами, находящимися в конъюгате с коллоидным золотом, и антителами в тестовой зоне, обеспечивают молекулы иммуноглобулинов класса G, являющиеся по своей структуре мономерами.

Проведя анализ имеющихся на рынке антител к H. pylori, с учетом ограниченных финансовых возможностей, для работы были отобраны антитела, представленные в таблице 4.

Таблица 4 – Перечень антител, используемых для получения конъюгата с наночастицами КЗ

При выборе учитывали необходимые для разработки иммунохроматографических тест-систем характеристики антител, о чем было сказано выше: достаточную для экспериментального маневра концентрацию антител, нахождение антител в растворе фосфатного буфера для обеспечения возможности увеличения периода работы с ними, отношение моноклональных антител к классу иммуноглобулинов G, возможность комбинации моноклонов в конъюгате с поликлонами в тестовой зоне. Для уменьшения риска получения отрицательного результата при разработке иммунохроматографической тест-системы для выявления возбудителя хеликобактериоза была отобрана пара моноклональных антител, получаемых фирмой «Биалекса» (Россия) и рекомендованных для разработки соответствующей иммуноферментной тест-системы.

Учитывая, что конъюгат антител с наночастицами коллоидного золота является одним из наиболее важных составляющих компонентов иммунохроматографической тест-системы, в отношении отобранной пары моноклональных антител при выполнении экспериментальной части работы целесообразно провести определение концентрации наиболее оптимальной для посадки на коллоидное золото, а также параллельно оценить адсорбционные способности полученных серий золота и выбрать наиболее перспективные варианты препарата для дальнейшего использования при приготовлении конъюгата.

С этой целью определяют «золотое число». «Золотое число» – это минимальное защитное количество гидрофильного полимера, достаточное для предотвращения коагуляции 10 мл золя золота при добавлении к нему 1 мл 10% раствора NaCl. Данный метод впервые был предложен Жигмонди. «Золотое число» является общей мерой защитного действия, поскольку эмпирически найдено, что сильное защитное действие, предотвращающее коагуляцию золя золота, обычно проявляется в такой же степени и в отношении других подобных ему золей [13].

Определение золотого числа. Для определения золотого числа, по данным литературы, используют различные по составу буферные растворы: фосфатно-солевой (ФСБ), карбонатно-бикарбонатный (КББ), сукцинатно-боратный (СББ) и др. Наиболее часто с этой целью применяют
0,005 М карбанатно-бикарбонатный буфер [18].

Оценку устойчивости золя проводят в зависимости от различных концентраций добавленного стабилизатора (биоспецифического зонда) с использованием агглютинационных титровальных планшетов с объемом лунок 250 мкл. При этом двойные разведения зонда (начальная концентрация 1 мг/мл) в количестве 20 мкл смешивают с 200 мкл золя золота с оптимальным значением рН, затем в каждую лунку добавляют 20 мкл 10% раствора NaCl.

Последняя лунка в ряду разведений конъюгата, не изменившая своего цвета после добавления солевого раствора, содержит минимальное количество полимера (антитела, антигена), необходимое для защиты раствора КЗ от его солевой агрегации – «золотое число» [58].

Оценку результата реакции проводят визуально и/или фотометрически. Практика свидетельствует о достаточной эффективности визуального контроля эффекта агрегации, выражающегося в заметном изменении цвета суспензии с розового на голубой. Рекомендуют построить изотерму адсорбции, фотометрически измеряя оптическую плотность золя (λ=580) после добавления убывающих концентраций зонда и раствора NaCl до конечной концентрации 1% (рис. 15)

Рис. 15 – Спектры поглощения исходного золя золота (1), золя, стабилизированного антителами (2) и после добавления NaCl (3) [56].

Из данных, представленных на рисунке 15, видно, как при стабилизации золя наблюдается увеличение и уширение пика кривой поглощения. Так, максимум пика поглощения нестабилизированного золя составляет 521 нм, оптическая плотность – 0,349; при конъюгации с антителами в концентрации 10 мкг×см^-3 максимум пика поглощения составляет 525-530 нм, оптическая плотность – 0,366. Добавление к биоконьюгату раствора NaCl до конечной концентрации 1% не приводит к изменению спектра поглощения в области 600-700 нм при концентрации антител 10 мкг×см^-3, что означает отсутствие агрегации частиц при высокой ионной силе раствора [56].

Для определения концентрации антител, оптимальной для получения стабильных, неагрегирующих конъюгатов с КЗ, проводят спектрофотометрический контроль раствора, содержащего антитела с наночастицами коллоидного золота в присутствии 10%-ного NaCl процесса, при длине волны D₅₈₀ (рис. 16).

Рис. 16 – Определение концентрации специфических антител, используемой для конъюгации с КЗ диаметром 30 нм [59].

Увеличение количества антител стабилизирует частицы КЗ, при этом D₅₈₀ возрастает, доходит до максимума и начинает снижаться, выходя на плато. Для обеспечения максимальной стабильности конъюгатов рекомендуют выбирать концентрации антител, на 10-15% превосходящие точки выхода D₅₈₀ на плато. На рисунке 16 выбранная концентрация антител (10 мкг×см^-3) отмечена стрелкой, нулевой уровень D₅₈₀ соответствует КЗ, не нагруженному антителами без добавления 10%-ного NaCl [59].

Определение «золотого числа» позволяет не только определить концентрацию антител для последующей конъюгации с наночастицами коллоидного золота, но и косвенно судить о качестве приготовленных препаратов коллоидного золота. Низкая адсорбционная способность (ниже 4 мкг×см^-3) коллоидного золота может свидетельствовать о непригодности серии препарата для последующего использования с целью приготовления конъюгата с антителами, невозможности разработки с использованием данной серии иммунохроматографической тест-системы с высокими аналитическими свойствами [60].