Сравнительная оценка маркеров, используемых для получения конъюгата их с антителами при разработке иммунохроматографических тест-систем

Маркеры, используемые в биохимических методах анализа (в том числе в тест-системах), обеспечивают формирование детектирующего сигнала, величина которого отражает содержание аналита. Регистрация специфических комплексов без использования маркера – непосредственно по изменению того или иного параметра реакционной среды – возможна лишь в крайне ограниченном числе случаев и при этом обычно характеризуется невысокой чувствительностью.

Существующее разнообразие маркеров крайне велико и классифицируется разными способами. Все маркеры можно разделить на индивидуальные молекулы (радиоактивные метки, ферменты, красители), молекулярные кластеры (наночастицы разной природы) и метки со сложной структурой (латексные или кремниевые частицы с инкапсулированными красителями).

Маркеры, используемые в иммунохимических тест-методах, должны обладать следующими характеристиками:

– простота детекции;

– высокая чувствительность детекции (высокое значение отношения сигнал / шум) в широком диапазоне условий;

– сохранение детектируемых свойств при работе со сложными матриксами;

– стабильность конъюгата маркер-иммунореагент при хранении.

Представленным требованиям в той или иной степени удовлетворяет лишь часть из используемых маркеров – ферменты, органические флуорофоры, липосомы и наночастицы различной природы.

Общее преимущество наночастиц как аналитических маркеров заключается в возможности использовать их большую суммарную поверхность, она позволяет увеличить количество целевого продукта, адсорбируемого на поверхности наночастиц, что обеспечивает ускорение аналитических реакций [18].

Рассмотрим основные маркеры, используемые в настоящее время для разработки иммунохимических методов анализа.

Наночастицы серебра. Наночастицы серебра по форме сферические, в растворе образуют крупные агрегаты. Наночастицы обладают способностью интенсивно поглощать свет, высокой химической активностью, способны к самопроизвольной агрегации, что делает актуальной задачу стабилизации наночастиц.

Существует возможность варьирования размерами наночастиц и зависящими от размеров спектрами поглощения. В тест-системах наночастицы серебра могут детектироваться колориметрическими и вольтамперометрическими способами и по изменению оптических свойств в процессе агрегации [29].

Углеродные наночастицы. Углеродные наночастицы разнообразны по структуре: наносажа, графен, однослойные и многослойные нанотрубки, фуллерены, аморфный углерод. В 1993 г. van Аmerongen А. впервые использовал наночастицы аморфного углерода как метку для иммунохроматографических тест-систем [30]. Углеродные нанотрубки обладают высокой прочностью и плотностью, высокой стабильностью, контрастностью окрашивания на мембране (черные частицы на белом фоне).

Для регистрации углеродных наночастиц используют их оптические и электрические характеристики, разрабатывая методы анализа с амперометрической и вольамперометрической детекцией [31]. На сегодняшний день главной проблемой является разработка экологически чистого способа производства нанотрубок, получения чистых препаратов нанотрубок.

Магнитные наночастицы. Эффективным аналитическим реагентом являются растворы парамагнитных частиц – коллоидные препараты кластеров металлов или их оксидов, способные перемещаться в магнитном поле. Наиболее широкое распространение в аналитических системах получили ферромагнетики – смеси оксидов железа Fe₂O₃ и FeO. Магнитные свойства наночастиц могут быть использованы как для концентрирования аналитических реагентов, так и для выявления специфических комплексов.

Применение магнитных наночастиц в иммунохроматографии описано в ряде работ [32]. Маркер может детектироваться как по отклику (намагничивание) на внешнее магнитное поле, так и по окраске (ферромагнитные частицы – интенсивного коричневого цвета). Магнитные детекторы выявляют маркеры во всем объеме мембраны, без каких бы то ни было эффектов экранирования, характерных для оптических методов [18].

Квантовые точки. Квантовые точки представляют собой нанокристаллы размером 1-5 нм. Особенностью этих частиц является способность к возбуждению в широком диапазоне длин волн. В состав квантовых точек входят ядро и дополнительные компоненты – металлическая оболочка и полимерное покрытие (рис. 4).

Рис. 4 - Структура квантовых точек [33].

Ядро может содержать комплексы полупроводниковых элементов, благородных и переходных металлов, обладающих магнитными свойствами. Металлическая оболочка препятствует неизлучательному переходу энергии, стабилизирует наночастицу и усиливает флуоресценцию. Полимерное покрытие используют для повышения стабильности, водорастворимости квантовых точек [33]. Конъюгаты квантовых точек с биомолекулами растворимы в воде, что обеспечивают высокую чувствительность биоаналитических исследований.

Коллоидное золото. Коллоидное золото (КЗ) в качестве маркера стало использоваться после работы 1981 года Horisberger M. [34]. На сегодняшний день КЗ является самым распространенным маркером благодаря доступности, простоте получения реагентов и детектирования. Интенсивная окраска частиц КЗ обусловлена эффектом поверхностного плазмонного резонанса.

Варьируя условиями синтеза КЗ, можно получить препараты различной формы и размера. В иммунохроматографии могут применяться препараты КЗ как малого диаметра – 3-5 нм (с практически эквимолярным соотношением антитело : коллоид в конъюгате), так и большого диаметра – до 50 нм [35]. В зависимости от требуемой чувствительности используются частицы с номинальным размером от 20 до 50 нм (рис. 5) [36]. Переход к более крупным частицам КЗ требует специальных решений по обеспечению их стабильности в растворе и предотвращению агрегации.

Рис. 5 – Коллоидное золото с номинальным размером частиц 5-50 нм [36].

Таким образом, в настоящее время активно применяются различные наноматериалы и наномаркеры в молекулярной диагностике заболеваний человека. Среди основных наноматериалов, применяемых для разработки диагностических тест-систем, следует назвать наночастицы золота с настраиваемым плазмонным резонансом и квантовые точки, характеризующиеся индивидуальными спектральными характеристиками в зависимости от размера частиц при неизменном химическом составе [37]. Однако у квантовых меток есть ряд основных недостатков: относительно низкие величины люминесценции контрольной и аналитической линий в сравнении с фоновой люминесценцией ИХ мембраны, их быстрое выцветание, что затрудняет регистрацию результатов анализа [38].

Поэтому КЗ на сегодняшний день является самым распространенным маркером в мембранных системах иммуноанализа. Интенсивная окраска, высокая электронная плотность золотосодержащего маркера позволяют легко обнаруживать частицы золота с помощью различных физико-химических методов. Возможность получения золей золота с различными размерами частиц и их узким распределением обеспечивают высокое разрешение этих методов [39]. Согласно исследованиям, средний диаметр сферических частиц 25±5 нм является наиболее оптимальным для эффективной сорбции антител на тест-полоску, миграции меченных КЗ антител через пористую структуру тест-полоски и для визуальной детекции сигнала с максимальной чувствительностью [40].