Диазореакция

Принцип метода. В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует сложное комплексное соединение оранжевого цвета.

Ход работы. К диазореактиву, состоящему из 5 капель 1 %-го раствора сульфаниловой кислоты и 5 капель 5 %-го раствора нитрата натрия добавляют 1–2 капли 5 %-го раствора тиамина и затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5–7 капель 10 %-го раствора бикарбоната натрия. На границе двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №2.Качественная реакция на витамин B₂

Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола:

Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов (флавопротеидов – FP) в виде коферментов флавинадениндинуклеотида (FAD) и флавинаденинмонодинуклеоитда (FMN). Флавопротеиды катализируют окислительно-восстановительные реакции. Они участвуют в окислении D-аминокислот, b-окислении жирных кислот, в работе дыхательных цепей митохондрий и микросом и др. Биологическое действие флавиновых ферментов связано с наличием окислительно-восстановительных свойств изоаллоксазинового кольца.

При недостатке в организме В₂ возникают поражения слизистых в виде хейлита, глоссита и др.

Принцип метода. Окисленная форма витамина В₂ представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В₂ основана на способности его легко восстанавливаться, при этом раствор витамина В₂, обладающий желтой окраской, приобретает сначала розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем обесцвечивается, так как восстановленная форма витамина В₂ бесцветна.

Ход работы. В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В₂, добавляют 5 капель концентрированной HCl, опускают зернышко металличес­кого цинка. Начинается выделение пузырьков водорода, восстанавливающего рибофлавин, жидкость при этом постепенно розовеет и обесцвечивается. Сравнивают обе формы витамина В₂ по флюоресценции, поместив каждую пробирку под освещение флюороскопа.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №3.Качественная реакция на витамин В₆

Группа витамина В₆: пиридоксол, пиридоксаль, пиридоксамин – являются производными 3-оксипиридина, носят общее название пиридоксина и обладают активностью витамина В₆.

В организме эти соединения подвергаются фосфорилированию при участии АТФ с образованием коферментов фосфопиридоксаля, фосфопиридоксамина, которые входят в состав ферментов, участвующих в белковом обмене, в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования аминокислот, десульфинирования, дегидратирования аминокислот, в образовании витамина PP из триптофана и в некоторых других реакциях.

При недостатке витамина В₆ у животных прежде всего нарушается обмен белков, у человека недостаточность этого витамина встречается редко.

Принцип метода. Витамин В₆ при взаимодействии с раствором хлорного железа образует комплексную соль типа фенолята железа красного цвета.

Ход работы. К 5 каплям 1 %-го раствора витамина В₆ приливают равное количество 1 %-го раствора хлорного железа и перемешивают. Развивается красное окрашивание.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа №4.Качественная реакция на витамин E

Витамин E существует в виде нескольких изомеров: a, b и g-токоферо­лов, которые отличаются друг от друга порядком расположения метильных групп в бензольном кольце. Токоферолы – маслянистые жидкости, растворимые в растительных маслах и жировых растворителях.

Витамин E является мощным антиоксидантом. Некоторые производные витамина E участвуют в окислительно-восстановительных реакциях, связанных с окислительным фосфорилированием.

Витамин E может депонироваться в мышцах и поджелудочной железе.

Принцип метода. Спиртовой раствор a-токоферола окисляется хлоридом железа (Fe³⁺) в токоферилхинон красного цвета:

Ход работы. В сухую пробирку берут 4–5 капель 0,1 %-го спиртового раствора a-токоферола, прибавляют 0,5 мл 1 %-го раствора хлорида железа, тщательно перемешивают. Содержимое пробирки приобретает красное окрашивание.

Выводы по результатам работы.

Лабораторная работа № 5.Количественное определение витамина C

Биологическая роль аскорбиновой кислоты в организме исключительно важна и многообразна. Она участвует в окислительно-восстановительных процессах и связана с системой глутатиона.

Аскорбиновая кислота участвует в синтезе стероидных гормонов в коре надпочечников и катехоламинов в мозговом слое надпочечников и необходима для процесса гидроксилирования как кофактор ферментов гидроксилаз, например дофамингидроксилазы и др. Она участвует в образовании тетрагидрофолиевой кислоты из фолиевой кислоты, процессинге коллагена (гидроксилировании лизина в оксилизин, пролина в оксипролин), ускоряет всасывание железа, а также активирует фермент желудочного сока пепсиноген, что особенно важно при недостатке соляной кислоты в желудочном соке.

Принцип метода. Метод основан на способности витамина C восстанав­ливать 2,6-дихлорфенолиндофенол (2,6 ДХФИФ – краска Тильманса), который в кислой среде имеет красную окраску, при восстановлении – обесцвечивается, а в щелочной среде окраска синяя. Для предохранения витамина C от разрушения исследуемый раствор титруют в кислой среде щелочным раствором 2,6 ДХФИФ до появления розового окрашивания.

Для расчета содержания аскорбиновой кислоты в продуктах (капуста, картофель, хвоя, шиповник и др.), используют формулу

0,088АГ ´ 100

X = ¾¾¾¾¾¾¾,

БВ

Ход работы.

1 Определение содержания витамина C в капусте.

Навеску капусты – 1 г тщательно растирают в ступке с 2 мл 10 %-го раствора соляной кислоты, объем доводят до 10 мл и фильтруют. Отмеривают для титрования 2 мл фильтрата, добавляют 10 капель 10 %-го раствора соляной кислоты и титруют 2,6 ДХФИФ до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 с.

По формуле, указанной выше, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты в 100 г продукта (в мг). По норме их должно быть (в мг): капуста – 25–60; хвоя – 200–400; шиповник – 500–1500.

2 Определение содержания витамина C в картофеле.

Взвешивают 5 г картофеля, тщательно растирают в ступке с 20 каплями 10 %-го раствора соляной кислоты (для того, чтобы картофель не темнел). Постепенно приливают дистиллированную воду – 15 мл. Полученную массу сливают в стаканчик, ополаскивают ступку водой, сливают ее по стеклянной палочке в стаканчик и титруют 0,001н раствором 2,6 ДХФИФ до розового окрашивания. В 100 г картофеля содержится 1–5 мг витамина C.

3 Определение содержания витамина C в моче.

Определение содержания витамина C в моче дает представление о запасах этого витамина в организме, так как наблюдается соответствие между концентрацией витамина C в крови и количеством этого витамина, выделяемым с мочой. Однако при гиповитаминозе С содержание аскорбиновой кислоты в моче не всегда понижено. Часто оно бывает нормальным, несмотря на большой недостаток этого витамина в тканях и органах.

У здоровых людей введение per os 100 мг витамина C быстро приводит к повышению его концентрации в крови и моче. При гиповитаминозе C ткани, испытывающие недостаток в витамине, задерживают принятый витамин C, и его концентрация в моче не повышается. C мочой у здорового человека экскретируется 20–30 мг/сут или 113–170 мкмоль/сут витамина C. У детей уровень экскреции этого витамина понижается при многих острых и хронических инфекционных и соматических заболеваниях.

Ход работы. В стаканчик или колбочку отмеривают 10 мл мочи и 10 мл дистиллированной воды, перемешивают, подкисляют 20 каплями 10 %-го раствора соляной кислоты и титруют 0,001н раствором 2,6 ДХФИФ до розового окрашивания.

Расчет содержания аскорбиновой кислоты в моче проводят по формуле

0,088АВ

X = ¾¾¾¾¾,

Б

Выводы. Записать полученный результат и дать его клинико-диагности­ческую оценку.

Рекомендуемая литература

Основная

1 Материал лекций.

2 Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 133–169; 1998. С. 204–242.

3 Николаев А. Я. Биологическая химия. М.: Высшая школа, 1989. С. 167–172.

Дополнительная

4 Экспериментальная витаминология / Под ред. Ю. М. Островского. Минск: Наука и техника, 1979.

5 Витамины / Под ред. М. И. Смирнова. М.: Медицина, 1974.

6 Бышевский А. Ш., Терсенов О. А. Биохимия для врача. Екатеринбург: 1994. С. 134–144.

7 Методы оценки и контроля витаминной обеспеченности населения / Под ред. В. Б. Спиричева. М.: Наука, 1984.