Измерение аналитического сигнала. Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры (на рис

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5).

В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноновую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуоресценции применяют лазеры.

Для выделения нужного спектрального интервала в флуориметрах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах - монохроматоры (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохроматор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным, а для выделения наиболее интенсивного излучения из спектра испускания - вторичным.

Рис. 21.5.Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции

Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуждающего света. Такой приём позволяет избежать наложения возбуждающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфоресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использовать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге l_возб и l_исп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается монохроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощающих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции проводится под углом 45° относительно возбуждающего излучения.

При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излучением, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как в спектрофотометрии, а фотоумножители.

21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люминесцентного анализа

К люминесцентной спектроскопии относят:

· флуоресцентный метод анализа (флуориметрия),

· фосфоресцентный метод анализа (фосфори­метрия),

· хеми- и биолюминесцентный метод анализа (люминометрия) и др.

Наиболее широкое применение среди перечисленных люминесцентных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает:

· большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать);

· более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами);

· удобным временным диапазоном.

Поглощение света - это практически мгновенный процесс (10^-15 - 10^-16 с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значительно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), меченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуно­анализа, одного из современных методов анализа биологических объектов.

Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для количественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции определяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуоресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах.

В количественном анализе используют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, концентрацию которого необходимо определить.

В флуоресцентном анализе используется:

· измерение собственной флуоресценции вещества;

· получение флуоресцирующих продуктов,в том числеиэкстракционная флуориметрия;

· определения, основанные на тушении флуоресценции;

· титрование с флуоресцентными индикаторами и др.

Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.

Обратите внимание на особенности структуры флуоресцирующих веществ – наличие в составе их молекул конденсированных ароматических систем.

В основе реакций получения флуоресцирующих продуктов могут лежать различные процессы: окисления, конденсации, образование комплексных соединений, ионных ассоциатов и др. Если образующийся продукт мало растворим в воде, неустойчив в водном растворе, либо избыток реагента мешает определению или влияет на устойчивость продукта, применяют экстракционную флуориметрию. Иногда вещество не флуоресцирует или слабо флуоресцирует в водной среде, но интенсивно флуоресцирует в среде органического растворителя.

Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуоресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), b-лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д.

К новым подходам в люминесцентной спектроскопии относятся:

· производная спектрофлуориметрия;

· синхронная спектрофлуориметрия;

· спектроскопия, основанная на эффекте Шпольского;

· флуоресцентная спектроскопия узких линий,

· фосфориметрия при комнатной температуре и др.