ЗАДАЧА 5

При получении штаммов суперпродуцентов аминокислот, таких, как треонина или лизина…

Вариант ответа

Современными методами тонкого органического синтеза можно синтезировать D и L-формы аминокислот в любых количествах, но все существующие способы их производства приводят к образованию рацематов. Таким путем можно получать рацематы лизина, глутаминовой кислоты, триптофана и других аминокислот. Вместе с тем химический синтез невозможен без достаточно большого количества агрессивных и токсичных веществ, что требует проведения допол­нительных организационных мероприятий и финансовых затрат для их утилизации. Кроме того, подобные соединения небезопасны для персонала. Получение 100% биологически активной L-формы ами­нокислот методом органического синтеза — процесс очень сложный и экономически оправдан лишь в редких случаях.

Альтернативой химическому синтезу служит микробиологиче­ский процесс, при котором специально подобранные селекцион­ные или сконструированные методами генной инженерии штаммы-продуценты способны осуществлять сверхсинтез аминокислот, например L-лизина, L-глутаминовой кислоты, L-триптофана, L-треонина в значительных количествах, что является определяю­щим фактором при выборе технологии производства аминокис­лот в промышленном масштабе. Однако при биосинтетическом получении в фармацевтической промышленности товарных форм L-аминокислот для кормового, пищевого или медицинского при­менения необходимо также использование тонкого органического синтеза на стадиях выделения, концентрирования и очистки суб­станций аминокислот.

Микробиологическое промышленное производство L-амино­кислот можно осуществлять по двум технологическим схемам.

Двухступенчатый способ предполагает образование и подготов­ку предшественника, а также биосинтез ферментного препарата микробного происхождения, который будет трансформировать пред­шественник в целевую аминокислоту. Это первая ступень. Вторая ступень — собственно процесс трансформации полученного на 1 стадии предшественника в аминокислоту с помощью фермент­ных систем микроорганизмов. Таким путем получают, в частности, L-лизин.

Одноступенчатый способ синтеза аминокислот с помощью микро­организмов основан на культивировании строго определенного штамма-продуцента целевой аминокислоты на среде определенного состава при соответствующих параметрах ферментационного про­цесса.

Промышленный штамм должен обладать способностью к сверх­синтезу нужной аминокислоты. Для этой цели выбирают полиауксотрофные мутанты, т.е. те клетки микроорганизмов, которые, с одной стороны, утратили способность самостоятельно синтезировать необхо­димые для роста и развития клетки различные аминокислоты, а с дру­гой — приобрели способность к сверхсинтезу целевой аминокислоты.

Микроорганизмы осуществляют контроль биосинтеза каждой аминокислоты по принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уровне самих ферментов, способных при избытке аминокис­лоты изменять свою активность (ретроингибирование), что совершен­но исключает перепроизводство аминокислоты клеткой в природных условиях. Из этого следует, что целью биотехнолога является нару­шение этих систем регуляции с дальнейшим отбором ауксотрофных мутантов на селективных средах с использованием мутагенов (УФ, рентгеновские лучи, нитрозосоединения и др.). Такие мутанты имеют в геноме дефектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Важно, что получение ауксотрофных мутантов-продуцентов ами­нокислоты возможно только для микроорганизмов с разветвленной цепью биосинтеза, т.е. по крайней мере две аминокислоты должны синтезироваться из одного предшественника. У таких ауксотроф­ных мутантов избыток одной аминокислоты при дефиците другой не приводит к подавлению активности первого фермента. Однако аминокислота, биосинтез которой нарушен, должна быть добавлена в ограниченном количестве (при синтезе лизина добавляется гомосерин или треонин на 1-й стадии). Продуцент лизина — Cotynebacterium glutamicum (коринебактерии) — имеет единственную β-аспартакиназу (фермент), активность которой регулируется путем согласованно­го ингибирования по принципу обратной связи. Этот мутантный штамм-продуцент является ауксотрофом по гомосерину и треонину. Для длительной работы ауксотрофных штаммов-продуцентов лизина в питательную среду вносят белковые гидролизаты в режиме дробной подачи (комплекс аминокислот).

Для получения L-треонина используют промышленный мутантный штамм Е. coli (энтеробактерии), где система регуляции биосинтеза ами­нокислоты основана на принципе дифференциальной регуляции изо-ферментами. Этот штамм — тройной ауксотроф. У него изменен 1 фер­мент цепи биосинтеза (нечувствительный к треонину), отсутствуют механизмы репрессии («хроническое голодание» по изолейцину), при помощи методов генной инженерии треониновые гены размножены на плазмидах, что значительно увеличило продуктивность штамма.

При получении аминокислоты методами прямого микробиологиче­ского синтеза применяют полупериодическую ферментацию (регули­руемую) с хорошей аэрацией (барботер) и перемешиванием (мешалка).