Метод Нозерн-блотт

Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране. Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами.

Саузерн-блот гибридизация - метод анализа структуры заданной области генома, основанный на:

- 1) расщеплении геномной ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции ;Эндонуклеазы рестрикции, рестриктазы — группа ферментов, относящихся к классу гидролаз, катализирующих реакцию гидролиза нуклеиновых кислот.

- 2) разделении множества полученных фрагментов с помощью электрофореза в плоской пластине агарозного или другого геля;

- 3) перенесении продуктов разделения на лист пористого материала, например, на нитроцеллюлозный фильтр таким образом, что все фрагменты ДНК переносятся на фильтр и закрепляются на нем, создавая отпечаток, идентичный распределению фрагментов в геле после разделения;

- 4) гибридизации фильтра с меченым радиоактивно или с помощью красителя фрагментом ДНК или РНК (пробой), который по последовательности соответствует анализируемому участку генома. В результате, проба за счет комплементарных взаимодействий связывается с теми участками фильтра, где находятся исследуемые фрагменты генома, и положение этих фрагментов идентифицируется по положению метки из пробы на фильтре.

с помощью Саузерн-блот гибридизации удается определять идентичность или различие длин фрагментов (полиморфизм длин рестриктных фрагментов, ПДРФ ), получаемых при рестриктном расщеплении одного и того же локуса в разных сравниваемых геномах.

Нозерн-блот — метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах.

Основным отличием метода нозерн-блот от Саузерн-блот является то, что определяемым субстратом является не ДНК, а РНК. Это обуславливает различия в методике — вместо нитроцеллюлозного используется фильтр из диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК и т. д.

Вопрос 31. Методы анализа генов. Метод Вестерн-блотт.