Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АвтомобилиАстрономияБиологияГеографияДом и садДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеталлургияМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРелигияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияТуризмФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника



Проведение ПЦР




Читайте также:
  1. I. Декларация-заявка на проведение сертификации системы качества II. Исходные данные для предварительной оценки состояния производства
  2. Анализ внутренней среды в стратегическом менеджменте. Срезы внутренней среды. Проведение анализа среды
  3. Анализ внутренней среды в стратегическом менеджменте. Срезы внутренней среды. Проведение анализа среды
  4. Билет 27. 3. Организация проведение врачебно-медицинского контроля за лицами, занимающимися АФК. Медико-санитарное обеспечение тренировочного процесса и соревнований
  5. Вопрос: Организация и проведение выборов в Государственную Думу
  6. Выбор аудиторов и проведение аудитов должны обеспечивать объективность и беспристрастность процесса аудита (ИСО 9001).
  7. Глава 2. Проведение правового мониторинга
  8. Демонополизация и развитие конкуренции в проектировании и строительстве; проведение конкурсов и организация тендеров (торгов) на выполнение проектов.
  9. Значение делового общения, подготовка и проведение деловой беседы.
  10. Методика разработки экскурсионного маршрута и проведение экскурсии. Приемы показа и рассказа в экскурсии.

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований

Компоненты реакции

Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

· ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.

· Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.

· Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов .

· Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты

· Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.

· Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора.

· Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, Если используется амплификатор с подогревающейся крышкой, этого делать не требуется.

Добавление пирофосфатазы может увеличить выход ПЦР-реакции. Этот фермент катализирует гидролиз пирофосфата, побочного продукта присоединения нуклеотидтрифосфатов к растущей цепи ДНК, до ортофосфата.

Праймеры

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18—30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

После гибридизации матрицы с праймером, последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Амплификатор

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C



Денатурация

Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96 °C на 0,5—2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.

Отжиг

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается равной температуре плавления праймеров. Время стадии отжига — 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов.


Дата добавления: 2015-04-18; просмотров: 10; Нарушение авторских прав







lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2021 год. (0.014 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты