Устройство светового микроскопа

Микроскоп (от греч. mikros - малый и skopeo - смотрю) - оптический прибор для получения увеличенного изображения мелких объектов и их деталей, невидимых невооруженным глазом.

Первый из известных микроскопов был создан в 1590 году в Нидерландах потомственными оптиками Захарием и Хансом Янсенами, смонтировавшими две выпуклые линзы внутри одной трубки. Позднее Декарт в своей книге "Диоптрика" (1637) описал более сложный микроскоп, составленный из двух линз - плоско-вогнутой (окуляр) и двояковыпуклой (объектив). Дальнейшее же совершенствование оптики позволило Антони ван Левенгуку в 1674 г. изготовить линзы с увеличением, достаточным для проведения простых научных наблюдений и впервые в 1683 году описать микроорганизмы.

Современный микроскоп (рисунок 1) состоит из трех основных частей: оптической, осветительной и механической.

Основными деталями оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: обращенный к глазу исследователя окуляр и обращенный к препарату объектив. Окуляры имеют две линзы, верхняя из которых называется главной, а нижняя собирательной. На оправе окуляров обозначают производимое ими увеличение (×5, ×7, ×10, ×15). Количество окуляров у микроскопа может быть различным, в связи с чем различат монокулярные и бинокулярные микроскопы (предназначены для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также тринокуляры, позволяющие подключать к микроскопу системы документирования (фото- и видеокамеры). Объективы представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, из которых передняя (фронтальная) линза производит увеличение, а лежащие за ней коррекционные линзы устраняют недостатки оптического изображения. На оправе объективов цифрами также указано производимое ими увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют в комплекте несколько объективов с разными степенями увеличения и поворотный механизм, предназначенный для их быстрой смены – турель, часто называемый «револьверной головкой».

Осветительная часть предназначена для создания светового потока, который позволяет осветить объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа предельно точно выполняла свои функции. Осветительная часть в прямых микроскопа проходящего света расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и электрический блок питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую и апертурную регулируемую диафрагмы). Конденсор состоит из системы линз, которые предназначены для собирания идущих от источника света лучей в одной точке – фокусе, которая должна находиться в плоскости рассматриваемого объекта. В свою очередь диафрагма расположена под конденсором и предназначена для регулирования (увеличения или уменьшения) потока лучей, проходящих от источника света.

Механическая часть микроскопа содержит детали, объединяющие описанные выше оптическую и осветительную части, а также позволяющие размещать и перемещать исследуемый препарат. Соответственно, механическая часть состоит из основания микроскопа и держателя, к верхней части которого прикрепляются тубус – полая трубка, предназначенная для размещения объектива, а также упомянутая выше револьверная головка. Ниже находится предметный столик, на который устанавливаются предметные стекла с исследуемыми образцами. Предметный столик может перемещаться в горизонтальной плоскости с использованием соответствующего устройства, а также вверх и вниз, что обеспечивает настройку резкости изображения с помощью грубого (макрометрического) и точного (микрометрического) винтов.

Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндаля, известным примером которого служит обнаружение пылинок в воздухе при освещении их узким лучом солнечного света. Данный вид микроскопии впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р.Зидентопфом в 1903 г. При его выполнеии объект освещают не снизу, а сбоку, в результате чего прямые лучи от осветителя в объектив микроскопа не попадают и поле зрения остается темным. Подобный тип освещения достигается использованием специального темнопольного конденсора (параболоида или кардиоида) с затемненной центральной частью. Кроме того, чтобы в объектив не попадали прямые лучи от осветителя, апертура объектива должна быть меньше, чем апертура конденсора (для уменьшения апертуры в обычный объектив помещают диафрагму или пользуются специальными объективами, снабженными ирисовой диафрагмой). В свою очередь объект освещается косыми боковыми лучами и в объектив микроскопа попадают только лучи, рассеянные частицами, находящимися в препарате. Сказанное объясняет, почему при темнопольной микроскопии микроорганизмы выглядят ярко светящимися на черном фоне (рисунок 3). Ограничениями же темнопольной микроскопии является то, что она позволяет увидеть только контуры объекта, но не дает возможности изучать его внутреннюю структуру.

В основе метода фазово-контрастной микроскопии, также предназначенного для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии лежит иной физический принцип, впервые предложенный Ф.Цернике в1935 году (Нобелевская премия по физике, 1953 г.). Суть его заключается в том, что в обычных условиях при прохождении пучка света через неокрашенный объект, отличающихся от окружающей среды только по показателю преломления, изменяется лишь фаза колебания световой волны, не воспринимаемая человеческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным необходимо превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитудные, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными деталями подобного устройства, которое может быть установлено на любом световом микроскопе, являются фазовоконтрастный конденсор и фазовый объектив. Фазовоконтрастный конденсор представляет собой револьверную конструкцию, в которой установлены кольцевые диафрагмы, обеспечивающие освещение препарата полным конусом света и соответствующие фазовым пластинкам в каждом из объективов. В свою очередь фазовый объектив отличаются от обычных тем, что в их главном фокусе расположена фазовая пластинка, имеющая форму кольца и получаемая нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. При этом установку освещения проводят так, чтобы весь свет, прошедший через кольцевидную диафрагму конденсора, в дальнейшем прошел через расположенное в объективе фазовое кольцо.

При изучении препарата весь свет, прошедший через его участки, в которых нет каких-либо объектов, без изменений пройдет и через фазовое кольцо, обусловив светлое изображение фона. В свою очередь свет, прошедший через имеющиеся в препарате частицы, например, бактериальные клетки, получит некоторое изменение фазы и, кроме того, разделится на два луча — недифрагированный и дифрагированный. Недифрагированные лучи, пройдя в дальнейшем через кольцевидную фазовую пластинку в объективе, получат дополнительный сдвиг фазы. Дифрагированные лучи пройдут мимо фазовой пластинки, и их фаза не изменится. В плоскости же полевой диафрагмы окуляра произойдет интерференция (наложение) дифрагированного и недифрагированного лучей, а так как они идут в разных фазах, произойдет их взаимное частичное гашение с уменьшением амплитуды. Благодаря применению этого метода микроскопии контраст живых неокрашенных микроорганизмов относительно фона резко увеличивается и они выглядят темными на светлом фоне (позитивный фазовый контраст).

Фaзoвoму кoнтpacту пpиcущ эффeкт Гaлo - появление светящегося ореола по контуру изображения объекта, что затрудняет изучение cвoйcтв кpaeвыx cтpуктуp наблюдаемых объектов, нaпpимep, не позволяет тoчнo зaмepять углы или расстояния. Для устранения данного недостатка используется вариант фазово-контрастной микроскопии – так называемый «хоффмановский контраст». Другой разновидностью данного метода является аноптральная микроскопия, преимуществами которой являются большая разрешающая способность с выявлением минимальных разностей плотности в неокрашенных препаратах.

Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия.Основы люминесцентной микроскопии были заложены А.Келером, обосновавшим принципиальную возможность подобного метода исследования. Первое устройство для его осуществления впервые было создано в 1911 г., однако широкое распространение получило двумя десятилетиями позже, когда для окрашивания препаратов были предложены специальные вещества – флюорохромы, избирательно связывающиеся с определенными структурами клеток (М.Хайтингер, 1933-1935). Чуть позже было предложено коньюгировать флюорохромы с антителами, что положило начало метода иммунофлюоресценции (А.Н.Кунс, 1942). В бывшем СССР наибольший вклад в развитие метода люминесцентной микроскопии и создание отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и устройств, основанных на этом принципе, внес М.Н.Мейсель (1953).

В основе люминесцентной микроскопии (от лат. lumen - свет; греч. micros -малый + skopeo - рассматривать) лежит принцип люминесценции (видимого глазом свечения) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. При этом физические основы возникновения свечения связаны с процессом поглощения определенными молекулами падающего на них света с последующим испусканием квантов с другой (большей) длиной волны (правило Стокса).

Первичная (собственная) флюоресценция возникает без специальной обработки препаратов и присуща ряду биологически активных веществ, таких, как ароматические аминокислоты, порфирины, хлорофилл, витамины А, В2, В1 , некоторые антибиотики (тетрациклин) и химиотерапевтические вещества (акрихин, риванол). Вторичная (наведенная) флюоресценция возникает в результате обработки микроскопируемых объектов флюоресцирующими красителями – флюорохромами. Некоторые из этих красителей диффузно распределяются в клетках, другие избирательно связываются с определёнными структурами клеток или даже с определёнными химическими веществами.

Для проведения данного вида микроскопии используются специальные люминесцентные (флюоресцентные) микроскопы, отличающиеся от обычного светового микроскопа наличием мощного источника освещения (ртутно-кварцевая лампа сверхвысокого давления или галогеновая кварцевая лампа накаливания), излучающего преимущественно в длинноволновой ультрафиолетовой или коротковолновой (сине-фиолетовой) области видимого спектра. Данный источник используется для возбуждения флюоресценции, прежде, чем испускаемый им свет проходит через специальный возбуждающий (сине-фиолетовый) светофильтр и отражается интерференционной светоделительной пластинкой, почти полностью отсекающими более длинноволновое излучение и пропускающими только ту часть спектра, которая возбуждает флюоресценцию. При этом в современных моделях люминесцентных микроскопов возбуждающее излучение попадает на препарат через объектив (!) После же возбуждения флюоресценции возникающий свет вновь попадает в объектив, после чего проходит через расположенный перед окуляром запирающий (желтый) светофильтр, отсекающий коротковолновое возбуждающее излучение и пропускающий свет люминесценции от препарата к глазу наблюдателя.

В силу использования подобной системы светофильтров интенсивность свечения наблюдаемого объекта обычно невелика, в связи с чем люминесцентную микроскопию следует проводить в специальных затемненных помещениях.

Важным требованием при выполнении данного вида микроскопии является также применение нефлюоресцирующих иммерсионных и заключающих сред. В частности, для гашения собственной флюоресценции кедрового или иного иммерсионного масла к нему добавляют небольшие количества нитробензола (от 2 до 10 капель на 1 г). В свою очередь в качестве заключающих сред для препаратов могут быть использованы буферный раствор глицерина, а также нефлюоресцирующие полимеры (полистирол, поливиниловый спирт). В остальном при проведении люминесцентной микроскопии применяют обычные предметные и покровные стёкла, пропускающие излучение в используемой части спектра и не обладающие собственной люминесценцией.

Соответственно, важными преимуществами люминесцентной микроскопии являются: 1) цветное изображение; 2) высокая степень контрастности самосветящихся объектов на черном фоне; 3) возможность исследования клеточных структур, избирательно поглощающих различные флуорохромы, являющиеся при этом специфическими цитохимическими индикаторами; 4) возможность определения функционально-морфологических изменений клеток в динамике их развития; 5) возможность специфического окрашивания микроорганизмов (с использованием иммунофлюоресценции).

Электронная микроскопия.Теоретические основы использования электронов для наблюдения микроскопических объектов были заложены У.Гамильтоном, установившим аналогию между прохождением световых лучей в оптически неоднородных средах и траекториями частиц в силовых полях, а также де Бройлем, выдвинувшим гипотезу о существовании у электрона одновременно корпускулярных и волновых свойств. При этом, благодаря чрезвычайно малой длине волны электронов, которая уменьшается в прямой зависимости от подаваемого ускоряющего напряжения, теоретически рассчитанный предел разрешения, характеризующий способность прибора отобразить раздельно мелкие, максимально близко расположенные детали объекта, у электронного микроскопа составляет 2-3 Å (Ангстрем, где 1Å=10^-10м), что в несколько тысяч раз выше, чем у оптического микроскопа. Первое изображение объекта, сформированное пучками электронов, было получено в 1931г. немецкими учеными М. Кноллем и Э.Руска.

В конструкциях современных электронных микроскопов источником электронов служит металл (обычно вольфрам), из которого после его нагревания до 2500 ºС в результате термоэлектронной эмиссиииспускаются электроны. С помощью электрических и магнитных полей формирующийся поток электронов можно ускорять и замедлять, а также отклонять в любых направлениях и фокусировать. Таким образом, роль линз в электронном микроскопе играет совокупность соответствующим образом рассчитанных магнитных, электростатических и комбинированных устройств, называемых «электронными линзами». Необходимым условием перемещения электронов в виде пучка на большое расстояние является также создание на их пути вакуума, поскольку в этом случае средняя длина свободного пробега электронов между столкновениями с газовыми молекулами будет значительно превышать расстояние, на которое они должны перемещаться. Для этих целей достаточно поддерживать в рабочей камере отрицательное давление приблизительно 10^-4 Па.

По характеру исследования объектов электронные микроскопы разделяют на просвечивающие, отражательные, эмиссионные, растровые, теневые и зеркальные, среди которых первые два являются наиболее часто используемыми.

Оптическая схема просвечивающего (трансмиссионного) электронного микроскопа полностью эквивалентна соответствующей схеме оптического микроскопа, в котором световой луч заменяется электронным лучом, а системы стеклянных линз заменяются системами электронных линз. Соответственно, просвечивающий электронный микроскоп состоит из следующих основных узлов: осветительной системы, камеры объекта, фокусирующей системы и блока регистрации конечного изображения, состоящего из фотокамеры и флуоресцирующего экрана. Все эти узлы соединены друг с другом, образуя так называемую «колонну микроскопа», внутри которой поддерживается вакуум. Другим важным требованием, предъявляемым к исследуемому объекту, является его толщина менее чем 0,1 мкм. Окончательное же изображение объекта формируется после соответствующей фокусировки прошедшего сквозь него пучка электронов на фотопленке или флюоресцирующем экране, покрытом специальным веществом – люминофором (аналогичен экрану в кинескопах телевизоров) и превращающем электронное изображение в видимое.

При этом образование изображения в просвечивающем электронном микроскопе связано главным образом с различной степенью рассеяния электронов различными участками исследуемого образца и в меньшей мере с различием в поглощении электронов этими участками. Контраст усиливают также, применяя «электронные красители» (четырёхокись осмия, уранил и др.), избирательно связывающиеся с некоторыми участками объекта. Устроенные подобным образом современные просвечивающие электронные микроскопы обеспечивают максимальное полезное увеличение до 400000 раз, что соответствует разрешающей способности в 5,0 Å. Выявляемое с использованием просвечивающей электронной микроскопии тонкое строение бактериальных клеток называют ультраструктурой.

В отражательном (сканирующем) электронном микроскопе изображение создается с помощью электронов, отраженных (рассеянных) поверхностным слоем объекта при его облучении под малым углом (приблизительно несколько градусов) к поверхности. Соответственно, образование изображения обусловлено различием рассеяния электронов в разных точках объекта в зависимости от его поверхностного микрорельефа, а сам результат подобной микроскопии предстает в виде структуры поверхности наблюдаемого объекта. Контрастность может быть усилена напылением на поверхность объекта частиц металла. Достигнутая разрешающая способность микроскопов такого типа составляет порядка 100 Å.