Методы окраски микробиологических препаратов

Клеточная стенка бактерий является их важным отличительным признаком.

В целях более подробного изучения клеточных структур бактерий микробиологические препараты окрашивают. Можно окрашивать живые бактериальные формы, однако такая окраска не даёт полной картины строения микробной клетки. В связи с этим приготавливают фиксированные препараты микроорганизмов. Фиксация убивает живые клетки и одновременно закрепляет их на поверхности предметного стекла.

Получение фиксированных окрашенных препаратов включает приготовление мазка, высушивание, фиксацию и окраску.

Приготовление мазка. На обезжиренное спиртом предметное стекло помещают маленькую каплю водопроводной воды и переносят в нее петлей небольшое количество исследуемого материала, как для препарата «раздавленная капля». Полученную суспензию равномерно размазывают петлей на площади 1 - 2 см максимально тонким слоем. Мазок должен быть настолько тонок, чтобы быстро высыхал после приготовления.

Высушивание мазка лучше всего производить при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок высыхает очень быстро. Если высушивание происходит медленно, препарат можно слегка нагреть в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки, держа стекло мазком вверх. Эту операцию следует проводить осторожно, не перегревая мазок, иначе клетки микроорганизмов деформируются.

Фиксация препарата преследует несколько целей: убить микроорганизмы, т.е. сделать безопасным дальнейшее обращение с ними; обеспечить лучшее прилипание клеток к стеклу; сделать мазок более восприимчивым к окраске, так как мертвые клетки окрашиваются лучше, чем живые. Самым распространенным способом фиксации является термическая обработка. Для этого препарат обычно трижды проводят через наиболее горячую часть пламени горелки, держа предметное стекло мазком вверх. Не следует перегревать мазок, так как при этом происходят грубые изменения клеточных структур, а иногда и внешнего вида клеток, например, их сморщивание. Для исследования тонкого строения клетки прибегают к фиксации различными химическими веществами. Фиксирующую жидкость наливают на мазок, либо препарат на определенное время погружают в стакан с фиксирующим раствором.

Окраска. Клетки микроорганизмов окрашивают главным образом анилиновыми красителями. Различают кислые и основные красители. К кислым относятся красители, у которых красящими свойствами обладает анион, у основных красителей хромофором является катион. Примерами кислых красителей служат эозин, эритрозин, нигрозин, кислый фуксин; все они интенсивно связываются с цитоплазматическими компонентами клетки. Основные красители - метиленовый синий, основной фуксин, генциановый фиолетовый, кристалл-виолет, сафранин — интенсивнее связываются с ядерными компонентами клетки. Высокая концентрация ДНК и рибосомальной РНК в клетке бактерии делает ее более чувствительной к основным красителям. В связи с этим в микробиологической практике применяются почти исключительно основные красители.

Различают простое и дифференциальное окрашивание микроорганизмов. В первом случае прокрашивается вся клетка, так что становятся хорошо видны ее форма и размеры. Дифференциальное окрашивание выявляет только определенные структуры клетки и запасные вещества.

1 Для простого окрашивания клеток микроорганизмов чаще всего пользуются фуксином, генциановым фиолетовым, метиленовым синим. Фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные палочки, лежащие над лотком, наносят на него раствор красителя и выдерживают в нем в течение 1 - 3 мин. Следят за тем, чтобы во время окрашивания краситель на мазке не подсыхал, и в случае необходимости добавляют новую порцию красителя.

По окончании окраски препарат промывают водой до тех пор, пока стекающая вода не станет бесцветной. Затем препарат высушивают на воздухе или осторожно промокают фильтровальной бумагой, помещают на окрашенный мазок каплю иммерсионного масла и просматривают с объективом 100х. Для получения более чистых препаратов краситель наносят на мазок, покрытый фильтровальной бумагой. Метод окрашивания в модификации Синева позволяет использовать вместо раствора красителя заранее пропитанную им фильтровальную бумагу. В правильно окрашенном и хорошо промытом препарате поле зрения светлое и чистое, окрашены только клетки.

Фиксировать и окрашивать можно также и препараты-«отпечатки». Фиксированные, окрашенные препараты могут храниться длительное время.

Форму клеток и их расположение (цепочки, розетки, пакеты, тетрады и т.д.) выявляют, как правило, на препаратах «раздавленная капля» при светло-польной или фазово-контрастной микроскопии. Для определения формы клеток мелких палочковидных бактерий, таких как Serratia marcescens, готовят препарат фиксированных клеток и применяют простое окрашивание. Клетки мелких бактерий, имеющих выросты - простеки (роды Caulobacter, Labrys, Prosthecomicrobium, Stella и некоторые другие), целесообразно исследовать методом фазового контраста или в темном поле. Естественное расположение клеток в колонии микроорганизмов, а также спор и спороносцев у актиномицетов и мицелиальных грибов изучают на препарате «отпечаток».

Необходимо помнить, что возраст культуры, состав среды и условия культивирования существенно влияют на морфологию и цитологию микроорганизмов.

2 Окраска по Граму (сложное окрашивание микроорганизмов) и ее использование для дифференциации бактерий с различным строением клеточной стенки.

Данный сложный (использующий более одного действующего вещества) метод окраски впервые был предложен в 1884г. датским ученым Х.Грамом (Ch.Gram) для окрашивания тканей, а позднее получил широкое распространение при окраске прокариот и был назван именем его разработчика.

Важное значение метода окраски по Граму в микробиологии определяется тем, что результаты окрашивания бактерий оказываются напрямую связанными с особенностями строения их клеточных стенок. Объяснением этого являются выраженные различия в строении клеточных стенок грамположительных (по данному методу окрашивающихся в фиолетовый цвет) и грамотрицательных (по данному методу окрашивающихся в красный цвет)бактерий. Первые из них имеют достаточно толстые слои из муреина (у эубактерий) или псевдомуреина (у архебактерий), удерживающие образующийся в протопласте комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и препятствующие его вымыванию из клетки при последующей обработке спиртом. В свою очередь грамотрицательные бактерии не образуют подобных гетерополисахаридов или содержат их в небольших количествах, недостаточных для предотвращения экстрагирования комплекса красителя с йодом из протопласта при его обработке спиртом. Сказанное объясняет, почему несмотря на кажущуюся простоту метода Грама, именно он получил наибольшее распространение в качестве важного таксономически значимого теста, с результатами которого хорошо коррелируют многие прочие свойства прокариот.

Для реализации данного метода готовят специальный краситель – карболовый раствор генцианового фиолетового или кристаллического фиолетового: 1 г красителя растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты до консистенции кашицы, прибавляют небольшими порциями 10 мл 96 % спирта, окончательно разводят 100 мл дистиллированной воды, сливают в бутыль, отстаивают и через сутки фильтруют. Вторым важным компонентом для окраски по Граму является раствор Люголя: в 10 мл дистиллированной воды растворяют 2 г иодида калия и 1 г иода кристаллического, смесь хорошо укупоривают и оставляют на сутки, после чего добавляют 300 мл дистиллированной воды.

Процедура окрашивания по Граму начинается с обработки фиксированных бактериальных клеток красителем кристаллическим фиолетовым, за чем следует обработка клеток раствором иода. Эти два компонента вместе образуют крупномолекулярный комплекс, нерастворимый в воде и слабо растворимый в спирте. Поэтому, используя спирт, клетки дифференцируют: при промывании в нем «грамположительные» клетки удерживают комплекс «кристаллический фиолетовый + иод» и остаются синими, а «грамотрицательные» обесцвечиваются. Для того же, чтобы также сделать их видимыми, образцы дополнительно окрашивают каким-либо контрастным красным красителем – обычно фуксином.

Среди множества предложенных в настоящее время вариантов, окрашивания по Граму (по Г.П.Калине, по Эткинсу и др.) достаточно широкое распространение получила модификацияпо А.И.Синеву, для реализации которой предварительно готовят полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового и высушенной.

Процедура сложного окрашивания микроорганизмов:

1) на предметном стекле готовят мазок бактериальной культуры, который фиксируют над пламенем горелки;

2) на мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, пропитанной раствором кристаллического фиолетового, на который наносят 2-3 капли воды и выдерживают в течение 2 мин;

3) снимают фильтровальную бумагу;

4) не смывая водой (!) на препарат наносят 2-3 капли раствора Люголя и выдерживают в течение 1 мин;

5) сливают раствор Люголя;

6) опускают предметное стекло в стаканчик с 95 % спиртом, где тщательно прополаскивают препарат в течение 0,5-1 мин, пока не перестанет отходить краситель;

7) тщательно промывают препарат водой;

8) наносят на предметное стекло раствор водного фуксина и прокрашивают препарат в течение 0,5-1 минут;

9) краситель сливают, тщательно промывают препарат водой, высушивают на воздухе и микроскопируют.

Считается, что в большинстве случаев интерпретация результатов окраски мазка по Граму не представляет трудностей, однако некоторые грамположительные микроорганизмы, в частности представители рода Bacillus, могут иметь грамотрицательную окраску. Напротив, некоторые штаммы грамотрицательных родов Acinetobacter и Moraxella проявляют тенденцию не обесцвечиваться спиртом, поэтому выглядят грамположительными.

Для уточнения таких «грам-сомнительных» реакций предложены особые методы. В Японии предложили метод «тяжа», позволяющий отличить с помощью КОН-теста грамотрицательные микроорганизмы от грамположительных. В основе метода с КОН лежит способность клеточной стенки грамположительных бактерий сохранять целостность при воздействии гидроокиси калия, тогда как клеточная стенка грамотрицательных микроорганизмов разрушается при указанном воздействии.

Методика выполнения работы.

На предметное стекло наносят каплю 3 %-ного водного раствора КОН. Петлей вносят суточную агаровую культуру исследуемых бактерий и тщательно эмульгируют. При положительной реакции, если суспензия в капле становится вязкой, нити слизи тянутся за петлей на 0,5 – 2,0 см и даже дальше, это - грамотрицательные бактерии, если нет – грамположительные бактерии. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Образование слизистой консистенции после обработки грамотрицательных бактерий КОН обусловлено выходом из их клеток ДНК, являющейся вязким компонентом.