Методические указания для самостоятельной работы

Практическая работа № 21.

Тема занятия:«Методы и питательные среды для культивирования анаэробов»

Составила преподаватель Якимова Л.М.

Минск

Практическая работа № 17

Тема занятия:«Методы и питательные среды для культивирования анаэробов»

Цель занятия:познакомиться с основными методами и питательными средами для культивирования анаэробов.

Самостоятельная работа:

1. Изучение устройства микроанаэростата и газогенерирующих пакетов
2. Знакомство с питательными средами, используемыми для культивирования анаэробов
3. Посев почвенной болтушки на среду Китт-Тароцци и на обезжиренное молоко для выделения анаэробов

Методические указания для самостоятельной работы

Исследование на анаэробы производят при:

1. поражении ЦНС – абсцессы мозга, эмпиемы, менингиты.
2. поражении сердечно-сосудистой системы – эндокардиты, сепсис, септический тромбофлебит.
3. поражении дыхательных путей – абсцедирующая пневмония, эмпиема легких, плевры.
4. поражении ЖКТ – интраабдоминальные генерализованные процессы, абсцессы печени, параректальные абсцессы, послеоперационные осложнения при операциях на брюшной полости, аппендицит с перитонитом.
5. акушерско-гинекологических заболеваниях – эндометриты, абсцессы маточных труб, сепсис после аборта, абсцессы бартолиниевых желез, тазовые абсцессы.
6. инфекциях мочевыводящих путей – пиелонефриты, циститы.
7. поражении глаз, уха, полости рта – синуситы, отиты, периодонтиты, кариес зубов, конъюнктивиты, гингивиты.
8. поражениях костей и суставов – остеомиелиты, артриты, бурситы.

Исследование на неклостридиальные анаэробы проводят при наличии хотя бы одного из следующих признаков:

1. Неприятный запах в очаге

2. Некротизация тканей и абсцедирование.

3. Локализация очага вблизи слизистой.

4. Развитие инфекции на фоне лечения аминогликозидами.

5. Черное окрашивание экссудата (привотелла,порфиромонас).

6. Септический тромбофлебит рядом с очагом

Материал для исследования зависит от очага и формы инфекции. Жидкий материал (кровь, раневое отделяемое) забирают шприцем (игла должна быть заполнена материалом и втыкается в стерильную резиновую пробку). Посев надо делать у постели больного, при невозможности – хранить и транспортировать не позже 2 часов. Кусочки органов и тканей забирают тампоном. Тампоны должны быть очень тонкими (готовят из проволоки 2 мм толщиной как бакпетля). Вата должна быть детоксицирована путем кипячения в фосфатном буфере рН 7,4 15 мин для удаления оксикислот с последующим подсушиванием в сухожаровом шкафу и автоклавировании. Кусочки органов и тканей и детоксицированные металлические тампоны увлажняют консервирующей смесью(8 частей фосфатного буфера рН 7,2-7,4 +1 часть стерильного глицерина+1 часть лизированной крови, полученной путем 5-ти кратного замораживания и последующего оттаивания флакона со стерильной кровью). Для забора материала необходима система: стерильные 3-жды увлажненные в консервирующей смеси тампоны, стерильная пробирка, стерильная трубка-проводник (изготавливается из пастеровской пипетки длиной 4-5-6 см). Систему хранят в морозильной камере 1 неделю. За 10 мин. до забора материала систему извлекают из морозильной камеры для подогрева при комнатной температуре, вставляют в рану на глубину 2 см трубку-проводник с тампоном, а затем извлекают, трубку сбрасывают, а тампон помещают в стерильную пробирку. Лабораторная диагностика анаэробных инфекций требует:

1) анаэробных условий культивирования.

2) хороших питательных сред с добавками, гемином.

3) селективных сред.

4) параллельного посева и на аэробную флору.

5) микроскопирования нативного материала.

Для культивирования анаэробов используют специальное оборудование:

1. Микроанаэростаты (МИ-752) – металлические банки или банки, изготовленные из прочного полиэтилена, с крышками, на которых укреплены монометр и 2 клапана: 1- для откачки воздуха, 2 – для подачи газа (N₂, Н₂, СО₂, природного газа). Внутрь анаэростата помещают штативы для чашек. Можно внутрь микроанаэростата помещать газогенерирующие пакеты, представляющие собой пакет, внутри которого находятся соли лимонной кислоты или другие вещества, при добавлении к которым воды идет химическая реакция и выделяется газ. Для удаления следов О₂ в микроанаэростат помещают палладиевый катализатор, поглощающий кислород (палладиевая стружка). Палладиевая стружка укладывается в полиэтеленовый пакет, который открывается перед помещением в микроанаэростат. После работы эффективность действия палладиевого катализатора снижается, в связи с чем возникает необходимость его регенерации, что достигается обработкой в сухожаровом шкафу при 160^оС 1-1,5 часа (регенерировать палладиевую стружку можно до 60 раз). Завернутый перед прожариванием в бумагу палладий сохраняет способность поглощать О₂ в течении 2 недель, а при герметизации упаковки 1-2 месяца. В микроанаэростат рекомендуется помещать индикатор анаэробиоза – бумажку, смоченную ризазурином (розовая окраска) или метиленовым синим (голубая окраска). Если после 1-2 часов пребывания в анаэростате индикаторная бумажка белеет, то кислорода в анаэростате нет. Если же при извлечении чашек бумажка остается окрашенной, это свидетельствует о наличии кислорода в чашках.

2.Система полиэтиленовых пакетов с зажимами. В пакет помещают газ-пак, катализатор, индикаторные бумажки и не более 2 чашек с культурами, герметично закрывают зажимом и помещают в термостат. При отсутствии палладия в газ-пак или микроанаэростат можно поместить смесь из 5 г пирогаллола и 10 г Na₂CO₃, поглощающих кислород. Вместо индикаторной бумажки можно пользоваться кусочками марли, пропитанными раствором из 4,2 мл 10% глюкозы, 0,1 мл 1н NaOH и 0,1 мл 1,5% водного раствора метиленовой сини или же смесью из 10 мл тиогликолевой среды и 3 капель 1 % водного раствора метиленовой сини. Импортные анаэростаты имеют ряд преимуществ по сравнению с отечественными. Прозрачные банки из оргстекла позволяют наблюдать рост микроорганизмов без нарушения герметичности внутренней среды. Наличие клапанов обеспечивает возможность замены вакуума газовой смесью (достигается это путем 3-кратного чередования откачки воздуха и запуска газовой смеси). При работе с таким анаэростатом перед открытием его нужно вначале выпустить газ вдали от источника огня (лучше в вытяжном шкафу).