Питательные среды для культивирования анаэробов.

Основой для приготовления всех сред является анаэробный кровяной агар(36гр эритрит-агара для бруцелл+1гр растворимого крахмала+0.4гр(NH₄)₂SO₄+1гр NaHCO₃+1л дистиллированной воды). Можно использовать Колумбиа-агар,, агар Шедлера, Вильсон-Чидлер агар.

Среда №1 – неселективный кровяной анаэробный агар (к охлажденной до 50⁰ основе+5 % лизированной крови +5 % свежей крови+1 мл 1% спиртового раствора викасола). Для приготовления 1% викасола 0.2гр витамина К растворяют в 20 мл 96⁰ спирта. На этой среде растут все анаэробы, в т.ч. и клостридии.

Среда №2 – НКТ – гемагар (налидиксовая кислота и твин). К 1л расплавленной и охлажденной до 50⁰ среды №1 добавляют 1 мл налидиксовой кислоты(3 капсулы по 500мг растворяют в 45 мл стерильной воды и 5 мл 0.1н NaOH) и 1 мл твин-80. Это селективная среда для грамположительных анаэробов, т.к. твин стимулирует рост грам + анаэробов, налидисовая кислота угнетает рост Грам+ клостридий

Среда №3 – НКР – гемагар – кровяной анаэробный агар с налидиксовой кислотой и ристомицином. К 1л расплавленной и охлажденной до 50⁰ среды №1 добавляют 1 мл налидиксовой кислоты и 1мл ристомицина(250мг растворяют в 50мл стерильного лимонно-кислого Na). На этой среде будут расти грам- неспорообразующие анаэробы (бактероиды, фузобактерии), т.к. ристомицин подавляет рост Грам+ анаэробов

Среда №4 – НКРБ – гемагар - анаэробный кровяной агар с налидиксовой кислотой, ристомицином и бриллиантовым зеленым. К 1л среды №3 добавляют 1 мл 1% раствора бриллиантового зеленого, для чего к 100мг бриллиантовой зелени приливают 1 мл стерильной дистиллированной воды и ставят в термостат на ночь. Это селективная среда для фузобактерий, т.к. бриллиантовый зеленый подавляет рост бактероидов. Вместо плотных сред можно использовать жидкие среды. Основой для их является среда, состоящая из 33гр сухой среды для контроля стерильности, 50мг гидролизата Хоттингера , 1 мл 1% раствора гемина на 1л и 1мл викасола.

НКТ-бульон – растут грам + и грам- анаэробы, кроме клостридий.

НКРБ-бульон – растут фузобактерии

НКР-бульон – растут все бактероиды и фузобактерии

НКРЖ-бульон – растут только бактероиды группы В.fragilis из-за желчи.

Стерилизовать среды надо во флаконах, добавки лучше вносить асептически после автоклавирования и разливать высоким столбиком под резиновую пробку. Перед употреблением жидкие среды редуцируют прогреванием на водяной бане 10-15 мин. Можно пробирки заполнить газовой смесью через резиновую пробку.

Лучшим методом выделения анаэробов является чашечный метод. Исследуемый материал засевают на чашку Петри с КА ( можно шоколадный агар) для выделения аэробов и на 3 чашки (1 из них-среда №1, 2 чашки с селективными средами) для выделения анаэробов.

Техника посева – метод фракционирования: материал тампоном или пипеткой наносится на 3 чашки: на среду №1 производят посев как посев осадка мочи, на вторую и третью - как посев по Голду, но на 3 секторах делаем по 40 штрихов. Рост на 1 секторе не учитываем (10⁴), рост на 2 секторе – диагностически значимый (10⁵), рост на 3, 4 секторах – выше диагностического (выше 10⁵).

Кроме того, на площадку среды №1 помещают диск с метронидозолом (для отличия облигатных анаэробов от факультативных – облигатные анаэробы чувствительны к метронидозолу и должны иметь зону задержки роста, но не меньше чем 2 см в диаметре). На первый перекрест секторов накладывают диск с пенициллином (к нему высокочувствительны клостридии – будет зона задержки роста и бактероиды, кроме B.fragilis, которые устойчивы к данному антибиотику). На среду №2 на первый перекрест секторов накладывают диск с пенициллином, а на второй – диск с полимиксином для дифференциации пептококков (они чувствительны к пенициллину, но устойчивы к полимиксину). На среду №3 на площадку накладывают диск с желчью для группы фрагилис, которая устойчива к желчи, на первый перекрест помещают диск с канамицином, к которому устойчивы бактероиды, кроме В. ureoliticus, а фузобактерии чувствительны. На второй перекрест среды №3 помещают диск с пенициллином, к которому чувствительны фузобактерии и бактероиды, кроме группы B.fragilis. На третий перекрест среды №3 накладывают диск с полимиксином, к которому чувствительны фузобактерии, бактероиды, кроме группы B.fragilis. Засеянные среды помещают в анаэростат (российского производства - на 3 суток, производства стран Западной Европы – на 2 суток).