Методы культивирования анаэробов

Для выращивания анаэробов необходимо создать определённые условия. Сущность которых заключается в удалении кислорода из питательной среды и окружающего его пространства. Другим обязательным условием, обеспечивающим выделение анаэробов из исследуемого материала, является внесение большого количества посевного материала в питательную среду. Для культивирования анаэробов предложены физические, химические и биологические способы.

Физические способы:

а) культивирование в анаэростате. Анаэростат со специальным устройством для откачивания воздуха. Культуры помещают в анаэростат, который герметически закрывают; с помощью вакуум-насоса откачивают из аппарата воздух и производят культивирование в термостате в течение определённого времени. Выращивать в анаэростатах культуры можно только на плотных средах так как жидкие среды при создании вакуума будут выплёскиваться из сосудов;

б) культивирование в атмосфере жидкого газа (например, азот, смесь азота с CO₂), замещающего воздух в анаэростате;

в) выращивание в высоком столбике агара с глюкозой – микроорганизмы на дне защищены от воздуха высоким слоем среды.

СПОСОБ ВЕНЬЯЛЯ-ВЕЙОНА:

Берут 4-5 пробирок с 0,5% сахарным агаром. В содержимое одной из них вносят пипеткой небольшое количество исследуемого материала и тщательно размешивают. Для уменьшения концентрации материала с целью получения изолированных колоний, засеянную среду в количестве, соответствующем объёму внесённого материала, переносят из одной пробирки во вторую, из второй в третью. Затем содержимым каждой пробирки заполняют капилляры трёх пастеровских пипеток. После заполнения вытянутый конец трубки запаливают и помещают в стеклянный цилиндр с ватой на дне. Через 2-3 суток в столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов-анаэробов. Выросшие колонии легко изолировать. Для этого капилляр подрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию микробов, находящуюся в агаре, извлекают петлёй и пересевают в свежую питательную среду.

ХИМИЧЕСКИЙ АРИСТОВСКИЙ МЕТОД:

На дно эксикатора наливают щелочной раствор пирогаллола или гипосульфита натрия (они жадно поглощают кислород). В эксикатор помещают пробирки или чашки с культурами закрывают герметически крышку и ставят в термостат.

БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ (по Фортнеру):

Совместное выращивание культур анаэробов и аэробов на дне чашки Петри.

В чашку Петри налагают толстым слоем 5% кровяной агар с 1-2% глюкозы. Посев посередине чашки в питательной среде вырезает стерильным скальпелем канавку шириной 1-1,5 см, которая делит питательную среду на две половины, одну из них засевают культурой анаэробов или исследуемым материалом, другую половину культурой анаэробов: чудесной палочкой или кишечной палочкой. Перед посевом чашки подсушивают в термостате. Засевают и засеянные чашки закрывают, свободное пространство между дном и крышкой заклеивают лейкопластырем или заливают парафином, чтобы предупредить поступление в чашку кислорода извне. Поглощая находящийся в чашке кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробов.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ АНАЭРОБОВ:

Единственным отличием питательных сред, применяемых для выращивания анаэробов, служит пониженное содержание в них свободного кислорода. Самым простым способом удаления растворённого кислорода является кипячение. Непосредственно перед посевом материала пробирки с питательными средами кипятят в водяной бане в течение 10-20 мин. Свежепрокипячёную питательную среду быстро охлаждают, погружая в лёд или подставляя под струю холодной воды, чтобы не дать ей насытиться кислородом воздуха и используют для посева. Для уменьшения диффузии кислорода из воздуха питательные среды заливают сверху стерильным вазелиновым маслом (толщина слоя 1-1,5 см). Засев среды производят пипеткой сквозь масло в наклонном положении пробирки. В качестве редуцирующих веществ используют глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин, гликокол, глютатион. Активно связываются с кислородом животные ткани паренхиматозных органов.

На этом свойстве животных клеток основано приготовление питательной среды Китта-Тароцци, широко применяемой для выращивания анаэробов. В жидкие питательные среды помещают иногда пористые вещества: вату, пемзу, которые отсорбируют на своей поверхности пузырьки воздуха.

РЕЦЕПТ СРЕДЫ КИТТА-ТАРОЦЦИ:

Печень животного, обычно говяжью, нарезают кусочками 1-1,5г, прибавляют по весу тройное количество МПБ или бульона Хоттингера нейтральной реакции, кипятят 30 минут. Бульон отфильтровывают, печень промывают под краном на сите. Отфильтрованный бульон разливают по 7-10 мл в пробирки. В каждую пробирку кладут по 4-5 кусочков отмытой печени. Бульон сверху разливают слоем вазелинового масла и стерилизуют в автоклаве под давлением 0,5 атм. 30 мин. Перед посевом среду кипятят 20 минут на водяной бане для удаления растворённого в ней кислорода. Посев производят на не остывшую среду (42-45⁰) пока она вновь не насытилась кислородом. При наличии роста анаэробов происходит помутнение среды и газообразование.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБЕЗЖИРЕННОГО МОЛОКА:

Для получения обезжиренного молока его доводят на огне до кипения, оставляют в прохладном месте на сутки. Вторично снимают верхний слой молока, пропущенного через сепаратор – обезжиренное молоко также может применяться для приготовления среды. Обезжиренное молоко разливают в стерильную посуду и стерилизуют текучим паром в течение 3 суток по 30 минут или один раз при 116⁰С в течение 20 минут. Молоко, изменившее белый цвет в коричневый, для выращивания микроорганизмов не применяется. При наличии роста анаэробов молоко створаживается.