Организация геномов неклеточных и клеточных организмов

Геномика. Организация геномов неклеточных организмов и прокариотов. Организация генома вирусов. Понятие о лизогенном и литическом циклах вирусов. Особенности генома и жизненного цикла ретровирусов. Геном бактерий. Плазмиды.

Организация генома эукариотов. Современные представления о геноме человека. Уникальная, умеренно- и многоповторяющаяся ДНК. Гены, кодирующие полипептиды, РНК. Мультигенные семейства. Суперсемейства генов и их продукты. Псевдогены. Транспозоны. Рассеянные и тандемные повторы. Мини- и микросателлитная ДНК. Внеядерная наследственность. Митохондриальный геном.

Геномика. Длительное время геномом называли гаплоидный набор хромосом. Накоп­ление сведений об информационной роли внехромосомной ДНК изменило определение термина «геном». В настоящее время он означает полный состав ДНК клетки, т.е. совокупность всех генов и межгенных участков. Можно счи­тать, что геном — полный набор инструкций для формирования и функцио­нирования индивида.

Общие принципы построения геномов и их структурно-функциональную организацию изучает геномика, которая проводит секвенирование, картирова­ние и идентификацию функций генов и внегенных элементов. Методы геномики направлены на расшифровку новых закономерностей биологических систем и процессов. Геномика человека является основой молекулярной ме­дицины и имеет важнейшее значение для разработки методов диагностики, лечения и профилактики наследственных и ненаследственных болезней. Для медицины первостепенное значение имеют исследования в области геномики патогенных микроорганизмов, поскольку они проливают свет на природу ин­фекционного процесса и создание лекарств, направленных на специфические мишени бактерий.

Геномика, несмотря на её «молодой возраст», подразделяется на несколько почти самостоятельных направлений: структурную, функциональную, срав­нительную, эволюционную, медицинскую геномику, фармакогеномику и др.

Структурная геномика изучает последовательность нуклеотидов в геномах, определяет границы и строение генов, межгенных участков и других структур­ных генетических элементов (промоторов, энхансеров и т.д.), т.е. составляет генетические, физические и транскриптные карты организма.

Функциональная геномика. Исследования в области функциональной геномики направлены на идентификацию функций каждого гена и участка гено­ма, их взаимодействие в клеточной системе. Очевидно, это будет осуществ­ляться путём изучения белковых ансамблей в разных клетках. Эту область исследований называют протеомикой.

Сравнительная геномика изучает сходство и различие в организации геномов разных организмов с целью выяснения общих закономерностей их строения и функционирования.

Эволюционная геномика объясняет пути эволюции геномов, происхождение генетического полиморфизма и биоразнообразия, роль горизонтального пере­носа генов. Эволюционный подход к изучению генома человека позволяет проследить за длительностью формирования комплексов генов, отдельных хромосом, стабильностью его частей, недавно обнаруженными элементами «непостоянства» генома, процессом расообразования, эволюцией наследствен­ной патологии.

Медицинская геномика решает прикладные вопросы клинической и профи­лактической медицины на основе знания геномов человека и патогенных орга­низмов (например, диагностика наследственных болезней, генотерапия, при­чины вирулентности болезнетворных микроорганизмов и т.д.). Все шаги эволюции живой природы, несомненно, должны были закреп­ляться в информационной системе ДНК (а для некоторых существ — в РНК), а также в организации её в клетке для выполнения консервативной функции сохранения наследственности и противоположной функции — поддержания изменчивости. Такое представление о формировании генома каждого вида наиболее обоснованно. Применительно к геному человека можно сказать, что эволюция человека — это эволюция генома. Такое представление подтверж­дается теперь многочисленными молекулярно-генетическими исследования­ми, поскольку стало возможным сопоставление геномов разных видов млеко­питающих, в том числе человекообразных обезьян, а также в пределах вида Homo sapiens геномов разных рас, этносов, популяций человека и отдельных индивидов.

Фармакогеномика. Во второй половине 50-х годов ХХ столетия было установлено, что индивидуальная вариабельность реакции организма на действие лекарственных средств может быть обусловлена генетическими факторами. Тогда же было сформулировано и понятие о фармакогенетике как о науке, изучающей влияние генетических факторов на особенности реакции организма в ответ на медикаментозное воздействие. Известно, что один и тот же ген у разных людей может быть представлен различными вариантами (аллелями). Генетический полиморфизм имеет место в тех случаях, когда носители каждого из аллелей составляют не менее 1–2% человеческой популяции. В последние годы накопилось большое количество данных о генах, которые кодируют синтез белковых молекул, оказывающих влияние на процессы всасывания, распределения, метаболизма и выведения лекарственных средств. В связи с полиморфизмом таких генов у некоторых пациентов лекарственные препараты могут быть неэффективными или оказывать выраженное токсическое воздействие. Известно, например, что в норме у различных групп исследуемых людей скорость элиминации лекарства из организма может отличаться в 4–40 раз. С учетом полиморфной экспрессии ферментов системы цитохрома Р450 (CYP2D6, CYP2C9 и CYP2C19) человеческую популяцию можно разделить на две группы: «медленно» и «быстро» метаболизирующих некоторые лекарственные вещества. При этом скорость метаболизма лекарств у представителей разных групп может отличаться в 10–100 раз. Соответственно возможно развитие побочных реакций в ответ на прием лекарственных препаратов в обычных дозах. Так, по данным Американской медицинской ассоциации в США в 1994 г. развитие побочных реакций явилось причиной госпитализации 2 млн. человек и более 100 тыс. случаев смерти. В последние годы побочные реакции на прием лекарственных препаратов занимают 4–6-е место среди причин смерти в США. Большинство из них обусловлено полиморфизмом генов, детерминирующих метаболизм лекарственных средств.

До настоящего времени лекарственные препараты разрабатывали и назначали на «популяционной» основе, без учета индивидуальных особенностей реакции организма. В среднем 10–40% людей не реагируют на фармакотерапию. В течение десятилетий фармакогенетические исследования носили академический характер и были в основном направлены на биохимическое изучение полиморфизма ферментов, метаболизирующих лекарственные вещества. Это было обусловлено отсутствием методов, позволяющих использовать данные фармакогенетических исследований для разработки лекарственных препаратов в фармацевтической промышленности и применения в клинической практике. Реализация Проекта человеческого генома способствовала быстрому совершенствованию новых геномных технологий, сопровождалась накоплением большого количества генетической информации, созданием различных баз данных (в том числе генетического типирования населения или групп пациентов с определенными заболеваниями) и развитием средств биоинформатики для их анализа. Качественный скачок в развитии методов идентификации и анализа генов, в том числе обусловливающих развитие различных заболеваний или определяющих особенности реакции организма на лекарственные вещества, способствовал развитию фармакогеномики. Выявление генов, детерминирующих реакции на фармакологические средства, позволяет разработать прогностические тесты, которые дают возможность определить еще до начала проведения медикаментозного лечения вероятность развития побочной реакции у конкретного пациента. Преимущества применения таких тестов очевидны. Во-первых, лечение станет более эффективным, поскольку пациенту сразу будут назначать именно «его» лекарственный препарат. Во-вторых, выбор оптимального метода фармакотерапии на самом раннем этапе лечения и снижение вероятности развития побочных реакций будут способствовать более четкому соблюдению режима лечения пациентом и сокращению медицинских расходов. В-третьих, идентификация генетических факторов вариабельности реакции организма на лекарственные средства поможет разрабатывать новые, более эффективные лекарственные препараты.

Сегодня во многих странах мира принимаются меры по ограничению расходов на медикаментозное лечение. В то же время крупные фармацевтические компании разрабатывают меньше новых активных соединений, чем это необходимо для сохранения 10% темпа роста объемов производства, обеспечивающего нормальное развитие фармацевтических предприятий. Дефицит инноваций привел к тому, что если затраты на научные исследования и разработки в 70-х годах составляли 11–12% от объема продаж фармацевтической продукции, то в 1994–1999 гг. — 19–21%. Одновременно возрастают расходы на исследование и разработку лекарственных препаратов, в том числе на проведение клинических испытаний. Известно также, что около 90% потенциальных лекарственных препаратов «отсеиваются» на этапе проведения клинических испытаний. В большинстве случаев это связано с недостаточной эффективностью или безопасностью исследуемых веществ. Таким образом, фармацевтическая промышленность нуждается в коренном изменении методов поиска и разработки новых лекарственных средств.

Фармакогеномика поможет решить эти задачи, так как будет способствовать выявлению оптимальных «мишеней» для фармакологического воздействия, отсеву неперспективных соединений на доклинических этапах их разработки, целенаправленному отбору групп пациентов для проведения клинических испытаний. В то же время создание лекарственных препаратов для лечения отдельных групп пациентов приведет к большей фрагментации рынка.

Недавно вице-президент компании «Glaxo Wellcome» А. Роузес в одном из интервью заметил, что когда больной идет к врачу, его интересуют только 4 вещи: диагноз должен быть точен в 100% случаев, эффективность лекарственного средства — 100%, побочные эффекты — 0% и все это должно предоставляться бесплатно. «Мы будем работать над первыми тремя проблемами», — отметил он. Учитывая эти потребности, биотехнологические компании стали предлагать услуги в проведении исследований по фармакогеномике. Некоторые компании создают базы данных медицинской информации и данных генотипирования больных с определенной патологией. Компании, имеющие геномные базы данных, объединяют их с данными по фармакогеномике и предлагают крупным фармацевтическим компаниям сотрудничество в разработке новых лекарственных средств и оптимизации применения уже используемых препаратов. Кроме того, они разрабатывают диагностические тесты для экспериментального и клинического применения.

Сегодня широко обсуждаются возможности разработки тестов, позволяющих одновременно определять весь «генетический профиль» пациента. Однако пока такие тесты не разработаны. В ближайшем будущем, очевидно, будут применять фармакогеномные тесты, благодаря которым появится возможность определить вероятность возникновения побочных реакций, развивающихся в результате применения конкретного лекарственного препарата или группы лекарственных средств, которые метаболизируются в организме аналогичным образом. Однако для практического применения в клинических целях необходимо, чтобы такие тесты отвечали ряду требований. Они должны быть относительно недорогими и предупреждать о возможности развития выраженных побочных реакций на препарат, который применяют для лечения достаточно большого количества больных. Они должны быть точными, процент ложноположительных или отрицательных результатов должен быть минимальным. Необходимо, чтобы они были автоматизированными и достаточно простыми в применении, чтобы их могли выполнять в обычных клинических лабораториях. Для разработки диагностического теста необходимо идентифицировать соответствующий ген, детерминирующий реакцию организма на действие лекарственного средства. Затем следует провести клинические исследования с участием репрезентативных групп пациентов, чтобы определить, какие последовательности ДНК позволяют предсказать реакцию организма на данное лекарство. После чего необходимо разработать тест, который можно будет использовать в условиях клинических лабораторий.

По мере открытия новых генов и выяснения их свойств возможна разработка и таких тестов, которые одновременно будут определять реакцию организма на самые различные лекарственные препараты. Например, в будущем можно использовать ДНК-чипы, на которых будут расположены последовательности всех известных генов, определяющих типы реакции на различные лекарственные средства.

Использование фармакогеномики на практике. По оценкам специалистов новые лекарственные препараты, при применении которых в клинике будут учитывать индивидуальные реакции организма пациента, могут появиться через 3 — 5 лет. Но сначала данные фармакогеномики будут использованы для повышения терапевтической эффективности и снижения риска развития побочных реакций в отношении тех лекарственных препаратов, которые уже используют в клинической практике. За рубежом фармакогеномика является перспективным направлением в области биотехнологий. В 1996 г. такого понятия просто не существовало. Сегодня же международные встречи по фармакогеномике проходят ежемесячно, еженедельно появляются статьи в прессе.

Известно, что в силу своих врожденных генетических различий люди по-разному реагируют на одни и те же медицинские препараты. Многие побочные эффекты могут зависеть именно от генетических особенностей индивидуумов. Следовательно, зная, какие гены отвечают за факторы, вызывающие как положительные, так и отрицательные последствия, можно сказать, как данный организм будет реагировать на лекарство.

Задачей фармакогеномики является разработка специальных тестов, с помощью которых можно определить, подходит ли то или иное лекарство определенному индивидууму или нет. В основе подобных тестов лежат новые технологии, которые с высокой скоростью позволяют определять точную нуклеотидную последовательность ДНК (сиквенирование). Кроме них фармакогеномика использует так называемые карты генотипа человека, с помощью которых можно сравнивать две группы индивидуумов (например, в первой группе определенный препарат вызывает побочный эффект, во второй группе этот эффект отсутствует). В этом случае, сравнивая карты генотипа человека, можно выяснить, какой ген приводит к появлению рассматриваемого побочного эффекта.

Разработка подобных тестов является одной из главных краткосрочных задач фармакогеномики. При этом тесты должны быть надежными, простыми в использовании.

Введение подобных тестов может привести к снижению стоимости лечения, так как больной с их помощью сможет выбрать себе оптимальное лекарство, вместо того чтобы принимать множество препаратов, прежде чем остановиться на одном – наиболее подходящем. В ближайшем будущем наибольшие усилия ученых будут направлены на разработку тестов для дорогостоящих препаратов.

Существует также надежда включить в один тест всю последовательность генов для одного человека. Расходы ведущих фармацевтических компаний на исследования в области геномики увеличились с 10 до 20% от средств, выделенных на разработку и исследование новых лекарств, и наиболее эффективные препараты в будущем будут созданы именно на основе фармакогеномики. С ее помощью производители ЛС смогут лучше прогнозировать возможные побочные эффекты препарата, планировать клинические испытания.

В настоящий момент на стадии разработки с использованием достижений геномики находится более 100 препаратов. Среди них средства для лечения сердечно-сосудистых, инфекционных и онкологических заболеваний.

Организация геномов неклеточных организмов и прокариотов.Один структурный ген в среднем состоит из 1500 н.п.. Самые малые вирусные геномы состоят из 3 генов (3600н.п. - фаг f2.).

Геном прокариот содержит минимум 468 генов (паразитическая микоплазма).

Минимальная величина генома эукариот характерна для дрожжевых грибов. Она эквивалентна 10 000 генам.

У человека (3.5х109 н.п.) количество ДНК достаточно для образования 1.5 млн. генов.

Приведенные данные показывают, что эволюция организмов связана с прогрессивным увеличением количества ДНК.

Организация генома вирусов.При изучении природы гена очень широко используются вирусы. Как известно, они относятся к облигатным внутриклеточным паразитам. Однако характерной особенностью вирусов, отличающей их от других внутриклеточных паразитов (например, бактерий), является то, что они паразитируют на генетическом уровне. Они подчиняют себе синтезирующий аппарат клетки, в которую они внедрились, замещая своими собственными генами гены хозяина, в результате чего вместо синтеза продуктов собственных генов клеточные механизмы начинают синтезировать продукты вирусных генов.

Вирусы были открыты в 1892г Д.И.Ивановским, а в 1917г Д’Эрелль открыл бактериофаги – вирусы бактерий (около 4500 фагов известно на сегодняшний день). Лучше всего изучены бактериофаги кишечной палочки – фаги Т-группы (7 штаммов).

В 50-х годах 20-го века удалось провести химический анализ высокоочищенных Т-четных фагов, который дал неожиданные результаты.

Во-первых, было установлено, что ДНК Т-четных фагов, в отличие от всех других известных в то время типов ДНК не содержит цитозина. Она содержит его аналог – 5-оксиметилцитозин (ОМ-С), т.о. нуклеотидные пары у фага – А =Т и Г=[ОМ-С]. Этот фаг имеет двухцепочечную ДНК.

Во-вторых, ДНК Т-фага содержит глюкозу, присоединенную к некоторым из оксиметильных групп ОМ-С.

Среди фагов самая маленькая молекула ДНК у фага Х174. Это тоже паразит Е.coli. ДНК этого фага состоит из 5000 нуклеотидов: А=25%, Т=33%, Г=24%, Ц=18%. Разное содержание азотистых оснований показывает, что они не могут образовывать пары, а значит, ДНК не имеет двухцепочечной конфигурации. Она состоит из одной цепи и имеет форму кольца.

Геном этого вируса содержит всего 10 генов. Причем три гена находятся в пределах других генов, т.е. эти гены перекрываются (рис.25).

Рис.25. Кольцевая ДНК фага Х174

Этот феномен (перекрывание генов) впоследствии был обнаружен и у других бактериофагов Е.coli. Так, у ряда РНК-бактериофагов (R17, MS2, QB) были известны всего три гена: репликазы, белка оболочки и созревания вирусной частицы. Однако после обнаружения мутации, блокирующей лизис зараженной клетки, выявлен ген, для которого уже не оставалось места на РНК фактериофага.

Тем не менее, обнаружили белок L размером в 75 аминокислот, кодируемый этим геном. Оказалось, что первый ген локализован частью в гене белка оболочки (47 оснований), частью в межгенном интервале (36 оснований) и частью в гене РНК-репликазы (142 основания).

Перекрывание генов - нередкое явление у вирусов и транспозонов, но это не означает, что код может быть перекрывающимся. В каждом из перекрывающихся генов триплеты все также считываются с фиксированной точки, а каждый нуклеотид принадлежит одному кодону.

5’ 3’

ген ген ген

белка созревания белка капсулы репликазы

Рис.26. Геном бактериофага f2

В 1961г. Леб и Циндер очень тщательно исследовали бактериофаг Е.coli – f2 (рис.26). Оказалось, он содержит одноцепочечную молекулу РНК (3600н.). Когда РНК этого фага проникает в клетку, то через 50 минут (латентный период) происходит ее лизис и высвобождается от 1000 до 10000 инфекционных частиц потомства.

В промежутках между генами данного фага расположены не транслируемые участки.