Экспрессия генов и её регуляция

Механизмы генной экспрессии. Понятие об экспрессии генов. Современное состояние центральной догмы молекулярной генетики. Свойства генетического кода. Этапы биосинтеза белка. Ферментативные механизмы и этапы транскрипции. Процессинг первичных транскриптов. Альтернативный процессинг, РНК-редактирование. Активация аминокислот. Молекулярная организация рибосом. Инициация, элонгация и терминация синтеза полипептидной цепочки. Посттрансляционная модификация белков.

Регуляция экспрессии генов. Регуляция экспрессии генов у прокариотов. Катаболические и анаболические опероны бактерий. Контроль экспрессии генов у эукариотов. Регуляция на уровне транскрипционных процессов. Белки – факторы транскрипции. Понятие об эпигенетической регуляции экспрессии генов. Метилирование ДНК, геномный импринтинг. Гормональная регуляция экспрессии генов. Контроль на уровне трансляции и посттрансляционных процессов.

Механизмы генной экспрессии. Хотя не все клетки млекопитающего выглядят и ведут себя одинаково, они имеют идентичный ге­нетический материал. Сегодня мы знаем, что око­ло 200 различных клеточных фенотипов в организ­ме человека отличаются тем, какие гены в них экспрессируются, а также сигналами, определяющими время экспрессии определенного гена или набора генов.

Генная экспрессия – это совокупность молекулярных механизмов реализации наследственной информации, благодаря которым ген проявляет свой потенциал в конкретном фенотипическом признаке организма.

Процесс экспрессии гена состоит из нескольких этапов:

Каждый этап, в свою очередь, имеет начало (инициация), продолжение (элонгация) и конец (терминация), где также осуществляется контроль генной экспрессии *

а) на основе гена ДНК синтезируется про-мРНК. Первый этап экспрессии называется «транскрипцией»; б) крупная молекула про-мРНК подвергается «процессингу», в результате этого значительно уменьша­ется в размерах. Образуется «зрелая» мРНК, считывание информации с которой упрощается. Биологический смысл процессинга - облегчение доступа к генетической информации; в) мРНК при участии тРНК «вы­бирает» необходимые аминокислоты, которые связываются на рибосоме в строго определенную последовательность полипептида. Процесс пере­носа информации с мРНК на полипептид называется «трансляцией»; г) синтезированный полипептид подвергается «модификации» и пре­вращается в активный белок; д) функционируя, белок делает свой вклад в морфологический или функциональный признак (фенотип) клетки или организма. Это процесс называется «экспрессией».

Рис.18. Схема этапов экспрессии гена ß - цenu гемоглобина

Схема механизма экспрессии представлена на рис.18 на примере экспрессии гена β-цепи гемоглобина. В процессе транскрипции участвует не только смысловая часть гена, но и другие регуляторные и структурные части. Образуемая про-мРНК содержит все элементы, характерные для гена ДНК. Процессинг существенно модифицирует про-мРНК, которая превращается в мРНК и содержит намного меньше структурно-функциональных элементов. На основе мРНК трансляция создает молекулы совершенно другой природы — полипептиды, ничего не имеющие общего с нуклеиновыми кислотами и обладающими со­вершенно другими свойствами и организацией. Модификация поли­пептидов приводит к еще одному природному явлению — появлению сложной пространственной организации молекулы белка. Происходит переход линейной информации ДНК и РНК в пространственную организацию протеина, которая, в свою очередь, является основой специфического пространственного взаимодействия молекул в живом организме, что и лежит в основе жизни и всех жизненных явлений. В данном случае процесс модификации обеспечивает пространствен­ную организацию – объединение четырех субъединиц гемоглобина в единый комплекс. В результате всех этапов экспрессии проявляется признак — способность к транспорту газов (О₂ и СО₂).

Современное состояние центральной догмы молекулярной биологии. Хромосомные ДНК содержат полную информацию обо всех бел­ках, синтезируемых в клетке. Эта информация закодирована в ДНК в виде особой последовательности азотистых оснований, называемой генетическим кодом. Специфическая последовательность нуклеотидов гена транскрибируется в мРНК и затем транслируется на рибосомах, обеспечивая строгий порядок аминокислот в полипептидной цепи. Представление о том, что информация хранится в ДНК и реализуется путем ее передачи от ДНК к мРНК, а затем к полипептиду, а при раз­множении путем репликации из одного поколения в другое, считается основной догмой (основным законом) молекулярной биологии. Она была предложена Ф. Криком в 1958 г. Схематически ее можно представить следующим образом:

Репликация транскрипция трансляция
ДНК ► ДНК ► РНК ► Белок

В 1970 г. Темин сообщил о том, что РНК, функционирующая как генетический материал в некоторых вирусах, может синтезировать комплементарную копию ДНК для внедрения в геном клетки-хозяи­на. Значит, у вирусов информация поступает не обязательно от ДНК к РНК, но может также и от РНК к ДНК (обратная транскрипция). Осуществляется она с помощью ферментов — ревертаз (лат. rever-sio — возврат). Это свойство нуклеиновых кислот используется в ген­ной инженерии.

Передача информации «запрещена» от белков обратно к нуклеиновым кислотам. Это означает, что модификации белков - генных про­дуктов не наследуются. Центральная догма отвер­гает ламаркизм. Все типы передачи гене­тической информации осуществляются на основе комплементарных межмолекуляр­ных взаимодействий: А=Т, Ц=Г.

Однако история с клонированием в 1996 году знаменитой ныне овечки Долли в шотландской фирме PPL Therapeutics (коммерческого отделения Розлин Института в Эдинбурге) позволяет взглянуть на центральную догму совсем по-иному. Коллектив ученых, возглавляемый Иэном Уилмутом, продемонстрировал, что им удалось, используя соматические клетки взрослого животного, получить клональное животное. Это значит, что биологические часы могут быть повёрнуты вспять, и развитие организма может начаться из генетического материала взрослой дифференцированной клетки, что полностью противоречит ранее общепринятой биологической догме.

Свойства генетического кода. Уникальность разнообразных клеток обусловлена уникальностью их белков. Клетки способны синтезировать индивидуальные белки за счет использования информации, записанной в молекуле ДНК. Эта информация существует в виде особой последовательности азотистых оснований нуклеотидов в нитях ДНК и называется генетическим кодом. Порядок азотистых оснований в мРНК, которая построена по матрице ДНК, определяет порядок связывания аминокислот в синте­зируемом полипептиде (табл.3). Каждая аминокислота кодируется последо­вательностью трех азотистых оснований (триплетом, или кодоном). Таким образом, генетический код представляет собой определенную строгую последовательность триплетов в молекуле ДНК, контроли­рующую порядок расположения аминокислот в молекулах белков.

В ДНК имеются четыре основа­ния, а в белках-20 аминокислотных остатков; синглетный код мог бы кодировать только четыре ами­нокислотных остатка, дублетный-4-4 = 16 амино­кислот, а триплетный образует 4 - 4 • 4 = 64 разных кодона.

Код не перекрывается, т.е. в последовательности оснований АВСDЕFGНI первые три основания, АВС, кодируют аминокислоту 1, DЕF- аминокисло­ту 2 и т.д. Если бы код был перекрывающимся, то последовательность АВС кодировала бы амино­кислоту 1, СDЕ-аминокислоту 2 и т.д. Непере­крывающийся характер кода относится только к случаю, когда рамка считывания не меняется. В коде отсутствуют запятые, т.е. нет знаков, отделяющих один кодон от другого.

Направление чтения закодированной записи - от 5'-кoнцa к З'-концу мРНК, являющейся транскриптом « + »-цeпи ДНК, считанным с нее в направле­нии 5' -» 3'. Первый с 5'- кoнцa кодон отвечает N-концевой аминокислоте полипептидной цепи. Сле­довательно, белки синтезируются от N-конца к С-концу.

Табл.3. Генетический код

Таблица кода указывает, какая аминокислота кодируется тем или иным кодоном. В таблице 5 первый (с 5'-кoнцa) нуклеотид помещен в левом столбце, второй - в верхней строке, а третий (на 3'-кoнцe)-в правом столбце. Из пред­ставленных в таблице 64 кодонов 61 кодон детер­минирует ту или иную аминокислоту (например, СUА отвечает лейцину Lеu), а три остальных кодона являются сигналами терминации. Эти три кодона называются нонсенс-кодонами, поскольку они не определяют никакой аминокислоты. Помимо этого, когда кодоны АUG для Меt и иногда GUG для Vаl находятся в начале последовательности и соответствующие аминокислоты должны быть помещены в начале белковой цепи, эти амино­кислоты обычно присутствуют в виде N-формильных производных. Когда же эти кодоны находятся в любом другом месте последователь­ности, то в пептидную цепь включаются нормаль­ные Меt и Vаl.

Код вырожден, т.е. большинство аминокислот кодируется более чем одним кодоном. Например, Рhе кодируется двумя кодонами -UUU и UUС. Кодоны, которые определяют одну и ту же аминокислоту, называются кодонами- синонимами. Вырожденность кода, как правило, вы­ражается в том, что у кодонов, определяющих одну и ту же аминокислоту, первые два основания фиксированы, а третье положение может занимать одно из двух, трех или четырех разных основа­ний. В частности, кодоны с одним из двух пиримидинов (С или U) в третьем положении всегда являются синонимами, в то время как кодоны с одним из двух пуринов (А и G) в третьем поло­жении бывают синонимами лишь иногда. Различия по всем трем положениям наблюдаются лишь в некоторых случаях (например, UСG и АGU оба кодируют Sеr).

Каждая тРНК может узнавать до трех кодонов. Химические свойства разных аминокислот нахо­дят отражение в структуре кода. Все кодоны с U во втором положении кодируют аминокислоты с гидрофобной боковой цепью (Рhе, Lеu, Не, Меt и Vаl). Если исключить терминирующие кодоны, то наличие А во втором положении определяет по­лярную или заряженную боковую цепь (Туг, Нis, Glп, Аsп, Lуs, Аsр и Glu). Рамка считывания задает положение первого ос­нования кодона мРНК (или гена). Поскольку код триплетен, число возможных рамок считывания равно трем. Обычно функциональный белок син­тезируется только при одной рамке считывания, но некоторые вирусы используют две или даже три рамки считывания, при этом синтезируются разные белки.

Мутация- это изменение в последовательности оснований генетического материала данного орга­низма. Знание генетического кода позволяет объяс­нить эффект некоторых мутаций.

Молчащая мутация- это такое изменение в нуклеотидной последовательности, которое приводит к образованию синонимичного кодона, и в резуль­тате аминокислотная последовательность кодируе­мого белка не изменяется. Структура кода такова, что молчащие мутации часто бывают, обусловлены изменениями оснований лишь в третьем положении кодона.

Замена (миссенс-мутация) ведет к замещению од­ной аминокислоты другой в результате такого из­менения последовательности оснований, которое не приводит к образованию синонимичного кодона. Так, заболевание серповидно-клеточная анемия возникает в результате замены Glu на Vаl в шестом положении ß-цепи гемоглобина человека. Это обусловлено изменением кодона GАА на GUА, т.е. заменой А на U во втором положении.

Мутация со сдвигом рамки обусловлена вставкой или удалением (делецией) одного или большего числа оснований в последовательности, так что при этом изменяется рамка считывания. Это приводит к изменению аминокислотной последовательности белка от точки мутации до С-конца молекулы.

Универсальность генетического кода означает, что все живые организмы-эукариоты, прокариоты и вирусы - используют один и тот же код. Хотя, вообще говоря, это положение справедливо, про­веденные сравнительно недавно (1981 г.) определе­ния нуклеотидной последовательности митохондриальных ДНК человека и дрожжей выявили не­которые необычные факты. Например, триплет UGА не является терминирующим кодоном, а ко­дирует Тгр, а триплеты АGА и АGС не кодируют Аrg, а являются терминаторами.

Генетический код был расшифрован в начале 60-х годов Ниренбергом, Кораной и их сотрудни­ками. Ниренберг получил клеточный экстракт Е. соli, содержавший все компоненты, необходимые для синтеза белка, включая рибосомы, все тРНК и аминоацил-тРНК-синтетазы. В систему добавляли полинуклеотид poly(U) (т.е. UUUUU UU...), функционировавший как искусственная мРНК. Оказалось, что poly(U) детерминирует синтез poly(Phe) (т.е. Рhе Рhе Рhе ...); сле­довательно, триплет UUU кодирует Рhе. Анало­гичные опыты показали, что триплет ССС коди­рует Рrо, а триплет ААА-Lуs. Следующий шаг заключался в использовании полирибонуклеотидов, содержавших два, три или четыре разных основа­ния, расположенных в случайном порядке. В ре­зультате этих исследований удалось определить состав других кодонов, но не последовательность оснований в них; так, было показано, что кодон, содержащий 2U и 1G, детерминирует Суs, но поря­док оснований оставался неизвестным. Корана ис­пользовал полирибонуклеотиды не со случайной, а с заранее заданной последовательностью и оп­ределил структуру нескольких кодонов. Эти иссле­дования получили дальнейшее развитие с помощью другого подхода, разработанного Ниренбергом. Он обнаружил, что тринуклеотиды вызывают связыва­ние специфических аминоацил-тРНК с рибосомой. Например, в присутствии UGU с рибосо­мой связывается только аминоацил-тРНК для Суs. Следовательно, UGU кодирует Суs. Три кодона, UАА, UАG и UGА, не кодируют никаких амино­кислот и определяют терминацию синтеза.

Рис.19. Схема организации генетического кода и процесса реализации наследствен­ной информации: 1 — ДНК, 2 — мРНК, 3 — полипептид.

Строгая последовательность нуклеотидов в молекуле ДНК кодирует определенную последовательность нуклеотидов в мРНК. Каждый триплет нуклеотидов кодирует одну конкретную аминокислоту. В результате трансляции, на основе генетического кода, на рибосомах синтезируется необходимый белок (рис.19).

Таким образом, генетический код ДНК имеет следующие фундаментальные характеристики:

Триплетность. Три соседствующих азотистых основания, на­зываемые кодоном, кодируют одну аминокислоту.

Специфичность. Каждый отдельный триплет кодирует только одну определенную аминокислоту.

Неперекрываемость. Азотистое основание определенного три­плета никогда не входит в состав другого кодона.

Отсутствие знаков препинания. Генетический код не имеет «пунктуационных отметок» между кодирующими триплетами в структурных генах.

Универсальность. Кодон в ДНК или мРНК определяет одну и ту же аминокислоту в белковых системах всех организмов от вируса до человека.

Избыточность. Одна аминокислота часто имеет более чем один кодовый триплет.

Коллинеарность. ДНК — линейная полинуклеотидная цепь, а белок — линейная полипептидная. Последовательность ами­нокислот в белке соответствует последовательности триплетов в его гене (у прокариот).

Однонаправленность — процесс считывания информации генетического кода с матричной цепи молекулы ДНК идет только в одном направлении — от 5 '- конца к 3 '-концу.

Этапы биосинтеза белка. Транскрипция ДНК и процессинг РНК. Транскрипция - процесс переноса генетической ин­формации от ДНК к РНК. Все виды РНК- мРНК, рРНК и тРНК - синтезируются в соответствии с последовательностью оснований в ДНК, служащей матрицей. Транскрибируется только одна (смысловая), так назы­ваемая « + » - цепь ДНК. Процесс транскрипции у прокариот и эукариот существенно различается.

Транскрипция у прокариот. ДНК-зависимая РНК-полимераза - это фермент, катализирующий синтез РНК. Он состоит из 4 субъединиц. Их комплекс называется холоферментом. Для инициации транскрипции необходимы холофермент, нуклеозидтрифосфат (всегда АТР или GTP) и наличие специального участка в ДНК, называемого промотором. Когда полимераза свя­зывается с промотором, происходит локальное рас­плетание двойной спирали ДНК и образуется от­крытый промоторный комплекс.

Промотор- это участок молекулы ДНК, имею­щий размер около 40 пар оснований и располо­женный непосредственно перед участком инициации транскрипции. Синтез РНК всегда начинается с оснований А или G в « + »- цепи ДНК. Участок связывания холофермента расположен выше сайта инициации (т. е. в направлении 3' -> 5' в «+ »-цепи) на расстоянии примерно 10 оснований. Если срав­нить последовательности оснований « + »-цепи ДНК у разных промоторов, то мы обнаружим, что они весьма близки, хотя и не идентичны. Эта так называемая последовательность Прибнова имеет вид ТАТРuАТРu, где Рu означает пурин (А или G). Таким образом, холофермент связывается со специфической последовательностью или группой последовательностей. Обычно на расстоянии около 40 оснований выше участка инициации находится второе место связывания РНК-полимеразы.

Элонгация цепи РНК- это та стадия транскрип­ции, которая наступает после присоединения при­мерно восьми рибонуклеотидов. В этот момент РНК-полимераза претерпевает некоторые структурные измене­ния, при котором от комплекса отделяется одна субъединица, а остающиеся три (кор-фермент) катализи­руют дальнейшее удлинение цепи РНК. При этом к цепи присоединяются те рибонуклеотидтрифосфаты, которые обеспечивают правильное спари­вание с « —»- цeпью ДНК. Движущийся вдоль ДНК кор-фермент действует подобно застежке-молнии, «раскрывая» двойную спираль, которая замыкается позади фермента по мере того, как соответствую­щие основания РНК спариваются с основаниями ДНК в « —»-цeпи. «Раскрытая» ферментом область простирается только на несколько пар оснований. Терминация (прекращение роста) цепи РНК проис­ходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами. Начало этих участков обычно обо­гащено GС-парами, а остальная последователь­ность -АТ-парами. GС-богатый участок часто пред­ставляет собой палиндром. Это означает, что при движении вдоль « + »-цeпи в одном направлении, а вдоль « — »-цeпи- в противоположном, читается одна и та же последовательность оснований. В остановке синтеза РНК именно на терминаторе важную роль играет р-белок.

Посттранскрипционный процессинг - это процесс созревания, при котором первичный РНК-транс­крипт модифицируется и превращается в зрелую РНК. Характер и степень модификации РНК зави­сят от типа РНК.

Молекулы мРНК у прокариот не подвергаются процессингу. У некоторых бактерий транскрипция и трансляция сопряжены, т.е. происходят одновременно. 5'-кoнeц мРНК может транслироваться на рибосоме и затем подвергаться деградации еще до завершения синтеза ее З'-конца. Молекулы тРНК вначале синтезируются в виде про-тРНК, которая примерно на 20% длиннее, чем соответствующая тРНК. Лишние последовательности, расположенные у 5'- и З'-концов, удаляются с помощью таких ферментов, как рибонуклеазы Q и Р. Иногда мо­лекула про-тРНК состоит из двух или более мо­лекул тРНК, соединенных между собой. Их разде­ление также осуществляется с помощью рибонуклеаз. Если З'-конец тРНК не несет концевой по­следовательности ССА, то эти основания присоеди­няются при постсинтетической модификации. Все тРНК содержат минорные основания, ко­торые являются химически модифицированными формами четырех главных оснований (А, С, G и U). Эта модификация происходит после завершения транскрипции.

Гены рРНК прокариот расположены в транс­крипционных блоках. Три гена рРНК Е. соli (16S, 23S и 5S) располагаются вместе с генами нескольких тРНК в одном таком блоке и транс­крибируются в виде одной молекулы РНК. Эти молекулы рРНК и тРНК отделены друг от друга спейсерной РНК. Расщепление первичного транс­крипта на отдельные составляющие катализирует рибонуклеаза Q; поскольку этот фермент специфи­чен к двухцепочечной РНК, предполагают, что в области спейсеров образуются двухцепочечные шпильки, которые фермент узнает и вырезает.

Транскрипция у эукариот. У эукариот для транскрипции используются три ДНК-зависимых РНК-полимеразы. Полимераза I локализована в ядрышке, где она катализирует синтез рРНК в виде большого первичного транс­крипта, содержащего молекулы рРНК 18S, 5,8S и 28S. Полимераза II находится в нуклеоплазме и, вероятно, участвует в синтезе первичного транс­крипта мРНК. Полимераза III также локализована в нуклеоплазме и участвует в синтезе тРНК и 5S-pPHK.

Синтез РНК (рис. 20) включает стадии инициации, элонга­ции и терминации, но в этих процессах часто принимают участие другие ферменты и последова­тельности оснований, чем у прокариот. Например, промоторные последовательности у эукариот отли­чаются от таковых у прокариот. Однако первыми основаниями, включаемыми в РНК при инициации, являются, как и у прокариот, А или G.

Молекулы мРНК обычно образуются из больших по размеру молекул-предшественников, называемых гетерогенной ядерной РНК (гяРНК). Для образования зрелой мРНК эти молекулы подвергаются модификации по 5'- и З'-концам и сплайсингу. После такой модификации транскрипты переносят­ся из ядра в цитоплазму.

Рис.20. Схема синтеза мРНК

Сплайсинг мPHK-этo удаление последователь­ностей РНК, соответствующих интронам ДНК, и соединение участков, которые транскрибированы с кодирующих последовательностей (экзонов). Место сплайсинга должно быть опре­делено с высокой точностью, поскольку ошибка даже в одно основание приведет к синтезу белка с неправильной аминокислотной последователь­ностью. Такая специфичность сплайсинга обеспе­чивается строго определенной последовательностью оснований в интроне, отвечающей обычно основа­ниям GU или GА в начале соответствующей РНК и основаниям АG-в конце.

Модификация 5'-кoнцa мРНК приводит к обра­зованию особой последовательности, называемой кэп-структурой. При модификации З'-конца к нему присоединяется последовательность poly(A) длиной 150-200 нуклеотидов.

Благодаря альтернативному сплайсингу число синтези­руемых белковых продуктов, очевидно, в 1,5-2 раза больше, чем число генов. Явление альтернативного сплайсинга заключается в следующем. Из одного и того же первичного РНК-транскрипта в процессинге РНК в разных тканях образуется не один, а несколько разных по длине мРНК-транскриптов. Соот­ветственно синтезированные полипептиды также будут различными. Таким образом, одна и та же ДНК-последовательность может кодировать не один, а несколько разных полипептидов.

Роль сплайсинга:

Создание новых генов в ходе эволюции.

Более полное экономичное использование записанной в геноме информации.

Регуляция активности генов.

Мутации, ведущие к нарушению сплайсинга на границе экзон-интрон (внутри интрона они бесследны) играют существенную роль в возникновении ряда наследственных болезней человека. Очевидно, что раз они так сильно меняют функциональную организацию гена, то им может принадлежать существенная роль и в процессах создания новых генов в ходе эволюции.

Процессинг тРНК у эукариот протекает при­мерно по такому же механизму, как и у прокариот. Функционально активные молекулы образуются из более длинного предшественника, который подвер­гается расщеплению и модификации с включением минорных оснований.

Процессинг рРНК также аналогичен соответст­вующему процессу у прокариот. Первичный транс­крипт содержит участки, отвечающие 18S-, 5,8S- 28S-pPHK, разделенные спейсерами. Как и у прокариот, эти три рРНК образуются при рас­щеплении спейсерных последовательностей.

Молекулярная организация рибосом. Субъединицы рибосом образуются в ядрышке, а затем через ядерные поры по отдельности поступают в цитоплазму. Их количество в цито­плазме зависит от синтетической активности клетки и может составлять от сотни до тысяч на одну клетку. Их функцией является синтез белков. Наибольшее количество рибосом обнаружено в клетках, интенсивно синтезирующих протеины. Встречаются также в митохондриальном матриксе и хлоропластах.

Рибосомы любых организмов — от бактерий до млекопитающих, характеризуются сходством структуры и состава, хотя клетки про­кариот имеют рибосомы меньших размеров и в меньшем количестве. Каждая состоит из нескольких разновидностей молекул рРНК и десятков разновидностей белков примерно в одинаковой про­порции. Маленькая и большая субъединицы находятся в цитоплазме по отдельности, пока не вовлечены в белковый синтез. Они объединяются друг с другом молекулой мРНК при необходимости синтеза и вновь разъединяются с прекращением процесса (рис.21).

Рис.21. Субъединицы прокариотических (а) и эукариотических (б) рибосом

Различные размеры и отличающийся состав белков и рРНК обусловливает разную чувствительность к некоторым антибиотикам. Например, тетрациклин действует только на рибосомы бактерии и подавляет синтез белков в этих клетках, не влияя на эукариотические клетки хозяина.

Молекулы мРНК, синтезированные в ядре, поступают в цитоплазму к рибосомам. Из цитозоля молекулами тРНК к рибосомам доставляются аминокислоты, где с участием ферментов и АТФ синтезируются белки. Если с одной молекулой мРНК соединяются несколько рибосом, то образуются полисомы, ко­торые содержат от 5 до 70 рибосом.

Механизм трансляции у прокариот (Е. соli). Стартовым сигналом к началу синтеза белка служит расположенный на мРНК кодон АUG, кодирующий метионин (Меt) [иногда это кодон GUС для валина (Vаl)]. В растущей полипептид­ной цепи первым аминокислотным остатком всегда будет либо Меt, либо Vаl. Тогда возникает за­конный вопрос: каким образом клетка отличает стартовый сигнал от кодонов АUG или GUС, расположенных в середине молекулы мРНК? Эта проблема решается с помощью модифицирован­ной формы Меt (или Vаl) и специальной иници­ирующей тРНК. Формилметионин (fМеt) и является той моди­фицированной формой Меt, с которой начинается синтез белка. Он присоединяется к молекулам тРНК определенного типа (тPHKf), отличным от тPHKMet, посредством которых Меt включается в средин­ную часть полипептидной цепи. И тPHKf, и тPHKMet узнают кодон АUG, но лишь тPHKf способна присоединяться к стартовому кодону АUG. Инициация синтеза белка начинается с момента образования инициирующего комплекса на 30S-субчастице, состоящего из мРНК, ЗОS-субчастицы рибосомы и молекулы aминoaцил-тPHKf с присо­единенным fМеt, которая связывается с участком Р. Следующим шагом является присоединение 50S-cyбчacтицы, в результате чего образуется 70S-инициирующий комплекс. Источником энергии для инициации синтеза белка служит реакция гидролиза GТР до GDР и Рj. На этом этапе необходимы еще несколько белков, называемых факторами ини­циации (IF1, IF2 и IFЗ).

Элонгация - это последовательное включение ами­нокислотных остатков в состав растущей поли­пептидной цепи. Каждый акт элонгации состоит из трех этапов: 1) узнавание кодона, 2) образо­вание пептидной связи и 3) транслокация.

Узнавание кодона заключается в связывании антикодона очередной молекулы аминоацил - тРНК с кодоном свободного участка А на рибосоме. Чтобы прикрепиться к рибосоме, тРНК с при­соединенной к ней аминокислотой должна сначала образовать комплекс с белком, называемым фак­тором элонгации ЕF-Тu, или EF1, который пред­варительно должен быть активирован с помощью GТР. После того как произойдет связывание всего комплекса тРНК-ЕFl -GТР с участком А рибосомы, осуществляется гидролиз GТР до GDР и Рj, удовлетворяющий энергетические потребно­сти на этом этапе элонгации. Фактор EF1 • GDР, неспособный более связываться с тРНК, покидает рибосому, на которой остается аминоацил-тРНК. Регенерацию активированного фактора EF1 ката­лизирует второй фактор элонгации, ЕF-Тs, или EF2, который замещает GDР в неактивирован­ном комплексе, в результате чего образуется ком­плекс EF1 • EF2.

Образование пептидной связи происходит лишь тогда, когда оба участка, А и Р, заняты молеку­лами аминоацил-тРНК. Часть 50S-cyбчacтицы пред­ставляет собой фермент пептидилтрансферазу, ка­тализирующий образование пептидной связи. В ре­зультате этой реакции растущая полипептидная цепь оказывается присоединенной к тРНК участка А, а тРНК участка Р высвобождается из ком­плекса с пептидом и несет на З'-конце группу —ОН.

Транслокация включает три акта, катализируемых еще одним фактором элонгации, EF-G(EFЗ), и энергетически сопряженных с гидролизом GТР. Сначала тРНК участка Р, не связанная с пеп­тидом, покидает рибосому, затем молекула полипептидил-тРНК переходит с участка А на Р и, наконец, рибосома перемещается вдоль мРНК на три нуклеотидных остатка в сторону З'-конца. В результате этих трех актов освобождается участок А и экспонируется очередной кодон, что позволяет начаться следующему циклу элонгации.

Терминация, т.е. окончание синтеза, происходит по команде кодонов UАА, UGА или UАG. В природе не существует таких молекул тРНК, антикодоны которых соответствовали бы этим кодонам. Вместо продолжения синтеза цепи происходит терминация, катализируемая специальными белка­ми, которые названы факторами терминации (RF1 и RF2) и которые узнают терминирующие кодоны, когда свободен участок А. Эти факторы изме­няют специфичность фермента пептидилтрансферазы таким образом, что происходит гидролиз связи между концевым пептидом и тРНК, а осво­божденная полипептидная цепь диффундирует от рибосомы. Вслед за этим происходит диссоциация комплекса мРНК- рибосома. Далее рибосома дис­социирует на 30S- и 50S-cyбчacтицы. После реассоциации этих субчастиц с другой молекулой мРНК весь цикл синтеза белка начинается сна­чала.

Трансляция у эукариот, осуществляющаяся в цитоплазме, включает такие же этапы, что и трансляция у прокариот. Основным отличием здесь является то, что первым остатком в растущей полипептидной цепи является Меt, а не fМеt. Тем не менее и в этом случае есть два типа молекул тРНК, узнающих кодон АUG: один- когда кодон инициирующий, а другой- когда он кодирует Меt, который должен быть присоединен в середине растущей полипептидной цепи. В роли факторов инициации и элонгации выступают различные белки. Еще одно существенное отличие состоит в том, что в цитоплазме эукариот рибосомы бо­лее крупные (80S).

У митохондрий и хлоропластов трансляция осу­ществляется в самих этих органеллах. Рибосомы, которые они содержат, представляют собой 70S-частицы и похожи на рибосомы бактерий. При инициации используется fМеt. Последовательность событий при трансляции у эукариот такова:

· информосомы переносят мРНК в цитоплазму,

· образуется комплекс старта трансляции: мРНК + малая субъединица рибосомы + стартовая тРНК,

· присоединение большой субъединицы рибосомы и начало синтеза белка от 5’ к 3’,

· в это же время происходит активация аминокислот путем их взаимодействия с АТФ,

· присоединение активированных аминокислот к специфической тРНК,

· собственно трансляция или полимеризация аминокислотных остатков на рибосоме в полипептидную цепь,

· окончание синтеза (терминация) – рибосома дошла до кодона-терминатора и весь комплекс – мРНК, малая и большая части рибосомы, тРНК, белок – распадается и при необходимости он снова может собираться к новому синтезу белка.

Весь процесс трансляции идет с помощью дополнительных приблизительно 50 специальных бел­ков: факторов инициации, элонгации, терминации. В общих чертах процесс трансляции одинаков у всех организмов.

Посттрансляционная модификация белков. Синтезированный из аминокислот полипептид — это практически прямолинейная молекула, не обладающая метаболической актив­ностью. Далее белок самопроизвольно и с помощью шаперонов принимает II, III и другие структуры. Новая полипептидная цепь высвобождается в цитоплазму, эндоплазматическую сеть или комплекс Гольджи, где завершается построение белковой молекулы. В процессе «созревания» она может терять некоторые концевые аминокислоты при помощи фермента экзопептидазы, а затем образовывать вторичную и третичную струк­туры. Молекулы могут объединяться с другими полипептидами для образования четвертичной структуры. Синтезированные макромо­лекулы могут объединяться с углеводными или липидными моле­кулами, а также встраиваться в биомембраны или другие комплексы клетки. Процессы изменения первоначальной линейной структуры полипептида и формирования пространственной структуры белковых молекул называются пострансляционной модификацией. В результате этого белки приобретают специфические свойства и функциональную активность.

Роль шаперонов в формировании бактериофагов. Для фолдинга вирусных белков тоже нужны шапероны. Рассмотрим это на примере бактериофага Т4, который размножается в клетках E.Coli. Вирион Т4 включает три компонента – головку, хвост и хвостовые фибрилы (короткие и длинные). Головка представляет собой белковую полую капсулу (капсид) в виде многогранника и плотно упакованную в ней линейную молекулу ДНК. По последним данным, ДНК фага Т4 содержит около 250 ге­нов. В состав же собранной фаго­вой частицы входит не более сотни различных белков. Остальные белки, кодируемые фаговой ДНК, играют вспо­могательную роль: обеспечивают протекание разных стадий фа­говой инфекции, в том числе и сборку готовых вирионов.

Среди этих вспомогательных белков имеются и шапероны. Т. е. фаг приносит с собой в клетку, помимо прочего, информа­цию о своих собственных шаперонах, которые будут обеспечи­вать фолдинг его собственных структурных белков. Совершенно поразительная «предусмотрительность »!

В то же время при фолдинге ряда фаговых белков использу­ются и бактериальные шапероны.