Молекулярная организация генов.

Современное определение гена. Структура гена про - и эукариотов. Классификация генов согласно их функциям. Структурные гены. Понятие о генах «домашнего хозяйства» и генах терминального дифференцирования. Типы регуляторных генов про - и эукариотов.

Как уже отмечалось, в 1865 г. Г. Мендель открыл гены. В его понимании ген – это абстрактный наследственный фактор. В 1909 г. В. Иогансен ввел в науку термин ген. В 1911 г. Т. Морган и сотрудники разработали «хромосомную теорию». Они счи­тали, что ген – это участок хромосомы, ответственный за проявление определенного признака. В 1926 г. Т. Морган написал книгу «Теория гена», где он отмечал, что ген – единица мутации, рекомбинации и функции.

В 1934 г. в Нобелевской лекции Т. Морган сказал: «Среди генетиков нет согласия во взглядах на природу генов... Если ген материальная единица, то он есть кусочек хромосомы».

В 1940 г. Джордж Бидл и Эдвард Татум (США) изучали генетический контроль метаболических реакций у хлебной плесени Neurospora crassa и выдвинули гипотезу « один ген – один фермент». Однако ген все еще оставался абстрактной единицей, и его при­рода была неясна!

Только когда доказали (Эвери, 1944; Ледерберг, 1951; Херши, 1952), что гены по­строены из ДНК, появилось определение: ген – это линейный участок ДНК, кодирующий 1 белок.

Позже выяснилось, что не все гены кодируют белки. Так в 1961 г. французские генетики Ф. Жакоб и Ж. Моно открыли регуляцию работы генов у прокариот и устано­вили, что в ДНК есть участки, не кодирующие белки. Эти участки ДНК назвали функ­циональной зоной, а участки, кодирующие белки – структурной зоной. Еще больше понятие гена усложнилось после открытия в 1977 г. прерывистого строения генов эукариот. Оказалось, что они имеют кодирующие участки (экзоны) и некодирующие (интроны). Интронов может быть от 1 до 50 на 1 ген. В интронах содержится больше ДНК, чем в экзонах:

В 1952 г. Барбара Мак-Клинток (США) обнаружила у кукурузы фенотипическое проявление транспозонов – прыгающих генов. К 1980 г. существование транспозонов было доказано многими учеными. Они присущи всем видам. Их сотни и тысячи в эукариотической клетке. Они находятся под генетическим контролем и «прыгают» в другое место хромосомы по команде. Благодаря транспозонам бактерии «разбираются» в антибиотиках и, погибая от одного, не реагируют на воздействие другого. Трипаносома тоже меняет гены местами и приобретает устойчивость к ферментам «хозяина». Транспозоны также запускают процессы старения. В 1976 г. у некоторых фагов были обна­ружены перекрывающиеся гены, т.е. на 1 участке ДНК расположено 2 гена.

Таким образом, структура гена оказалась очень сложной, понятие о нем расшири­лось, и исчерпывающего определения нет. Рабочая формулировка: под термином «ген» понимают последо­вательность нуклеотидов в ДНК, которая обусловливает определённую функцию в организме или обеспечивает транскрипцию другого гена. Функциональная единица гена – кодон. Структурная единица гена – пара нуклеотидов.

В результате сложных эволюционных превращений у каждого вида организмов сформировалась сложная система генотипа, которая представлена разными по функциям генами.

Ген – это участок молекулы ДНК, включающий промотор, транскрибируемую последовательность и терминатор (рис.15). Промотор – небольшой участок гена, к которому присоединяется фермент транскрипции. Кодирующая часть содержит информацию о последовательности нуклеотидов в РНК. Терминатор – сигнальный участок о завершении транскрипции.

Рис.15. Схема структурно-функциональной организации гена

Каждый из элементов гена имеет сложное строение и определенные функции.

Каждая из 23 пар интерфазная (G1) хромосома содержит одну молекулу ДНК. Размер ДНК в самой большой хромосоме 1 (хромосомы нумеруют по размеру) - 250 миллионов пар нуклеотидов, а в самой маленькой - 47 миллионов.

Гены расположены в линейном порядке. У прокариот линейные размеры гена согласуются с размерами структурного белка, а у эукариот размеры ДНК намного превосходят суммарные размеры значимых генов. Каждый ген имеет свое место расположения (локус) (рис.16). Совокупность всех генов называется геномом. Геном человека содержит 3,5·1000000000 нуклеотидных пар, что достаточно для образования 1,5 млн. генов. Однако исследования показывают, что организм человека имеет примерно 35000 - 40000 генов. Это значит, что в половозрелом организме используется только ~ 2 – 3% записанной генетической информации. Значительная часть генома используется на процессы эмбрионального развития, дифференцировке, роста и в дальнейшем не экспрессируется. Другая значительная часть избыточной ДНК входит в состав интронов. И еще большая часть ДНК представлена многочисленными семействами не имеющих смысла повторяющихся последовательностей. Повторяющиеся последовательности встречаются с частотой от 2 до 10000000 на одну клетку. Например, ген, кодирующий рРНК, повторяется около 2 тысяч раз. Очевидно, такие гены, могут кодировать группы белков или обладать пока неизвестными функциями.

Свойства генов:

· специфичность;

· целостность и дискретность;

· стабильность и лабильность;

· плейотропия; экспрессивность и пенетрантность.

Классификация генов:

Регуляторные Структурные

1. Активаторы (усилители); 1. Уникальные;

2. Репрессоры (глушители); 2. Повторяющиеся;

3. Промоторы; 3. Транспозоны;

4. Терминаторы; 4. Молчащие (мутант без экспрессии).

5. Операторы;

6. Разделители и др.

Рис.16. Расположение генов в интерфазной хромосоме. Гены в ДНК расположены в линейном порядке. Каждый ген имеет свое место расположения (локус). Теломерные и центромерные участки хромосом не содержат генов. Аналогичное расположение аллелей характерно для гомологичной хромосомы: 1 – теломеры, 2 – центромера.

Клетки млекопитающих способны синтезировать около 250 тыс. белков, а ДНК в клетке хватает на 5 млн. Значит, регуляторных генов в тысячи раз больше, чем не­посредственных исполнителей – структурных генов.

В начале и в конце каждого гена находятся регуляторные последовательности, которые определяют: в каких тканях, на каких этапах развития и при каких внешних или внутренних (например, гормональных) сигналах будет работать данный ген.

Регуляторные последовательности находятся не только рядом с генами, но и в участках, содержащих так называемую реторовирусную ДНК - остатки ретровирусных геномов, которые когда-то встроились в геном человека и переходят в его составе из поколения в поколение. Ретровирусы принадлежат к широкой группе генетических элементов, реплицирующихся с помощью обратной транскрипции. Некоторые ретровирусы не связаны с какой-либо болезнью, тогда как другие очень патогенны, такие как вирус гепатита В и вирус иммунодефицита человека. Ретровирусы инфицируют разнообразные виды позвоночных, от рыб до человека.

Во время репликации ретровирус копирует свой РНК-геном в ДНК, используя кодируемый вирусным геномом фермент - обратную транкриптазу (ревертазу). Вирусная ДНК встраивается в хозяйские хромосомы с помощью другого вирусного фермента - интегразы. Если вирусный геном встраивается в хозяйские гены, это блокирует работу гена. Если участок встраивания находится рядом с геном, то регуляторные элементы вируса могут влиять на работу клеточных генов. Встраивание «чужих» регуляторных последовательностей рядом с генами, отвечающими за чередование фаз деления и роста клетки, приводит к перерождению клетки в раковую.

При встраивании генома вируса в зародышевую линию клеток вирусная ДНК наследуется как менделирующий признак. Большинство вирусных последовательностей встроились в геном предков человека десятки миллионов лет назад. За прошедшее время в них накопилось множество мутаций и они утратили свою патогенность. Часть из них сохранила способность «прыгать» по геному, перенося регуляторные элементы. Эндогенные ретровирусы составляют около 3% ДНК человека.

Гены человека (также как и других эукариотических организмов) имеют сложную структуру. После синтеза РНК некоторые ее участки (их называют вставочными последовательностями или интронами) вырезаются, а оставшиеся (их называют экзонами) сшиваются в единую цепь, содержащую белок-кодирующую последовательность и сигналы регуляции трансляции. Интрон-экзонная структура генов достаточно сложна. Экзоны могут соединяться в различных сочетаниях, благодаря чему один ген может определять синтез нескольких десятков различающихся своей аминокислотной последовательностью белков. Различия интрон-экзонной структуры зрелой мРНК могут определять интенсивность синтеза одного и того же белка в разных тканях или на разных этапах онтогенеза.

Большинство генов в каждой клетке «молчит». Набор активных генов различается в зависимости от типа ткани, периода развития организма, полученных внешних или внутренних сигналов. Можно сказать, что в каждой клетке «звучит» свой аккорд генов, определяя спектр синтезируемых мРНК, кодируемых ими белков и, соответственно, свойства клетки.

В каждой клетке (кроме эритроцитов, у которых отсутствует ядро) работают гены, кодирующие ферменты репликации и репарации ДНК, транскрипции, компоненты аппарата трансляции (рибосомные белки, рРНК, тРНК, аминоацилсинтетазы и др. ферменты), ферменты синтеза АТФ и другие компоненты, необходимые для ведения «домашнего хозяйства» клетки. Заведуют «домашним хозяйством» около одной пятой всех генов.

Гены человека более комплексные, чем у других изученных организмов (на­пример, у дрозофилы). Благодаря альтернативному сплайсингу число синтези­руемых белковых продуктов, очевидно, в 1,5—2 раза больше, чем число генов.

Размер генов человека, число экзонов и интронов в них варьируют в широ­ких пределах (табл.2).

Функции генов. Накопленные сведения о генах человека позволяют выделить следующие группы по функциям первичного продукта: ферменты; модуляторы функции белков; рецепторы; транскрипционные факторы; внутриклеточный матрикс; внеклеточный матрикс; трансмембранные переносчики; каналы; клеточные сигналы; гормоны; экстраклеточные переносчики; иммуноглобулины и др.. Безусловно, есть ещё и гены с неизвестным пока действием.

Табл.2. Классификация генов человека по размеру

Наибольшую функциональную категорию составляют гены, кодирующие ферменты (31,2% общего числа). В 2 раза меньше генов — модуляторов белковой функции (13,6%). Они стабилизируют, активируют, свёртывают или вли­яют иным образом на функции белка. Каждая из остальных категорий генов составляет менее 10% общего числа.

Все клетки многоклеточного орга­низма возникают из зиготы путем митоза и получают полноценный набор генетической информа­ции. Однако, они отличаются друг от друга по морфологии, биохимическим и функциональным свойствам. Эти различия основаны на функционировании в разных клетках неодинаковых частей генома. Большая часть генома находится в клетках организма в неактивном, репрессированном, состоянии, и только 7-10 % активно транскрибируются. Функциональная активность генов зависит от тканевой принадлежности клетки, от периода ее, жизненного цикла и стадии индивидуального развития организма. Из активно функционирующих генов в большинстве клеток основная масса генов обеспечивает синтез белков общего назначения (белки рибосом, гистоны, тубулины и т.д.), тРНК и рРНК. Транскрибирование этих генов происходит путем присоединения РНК-полимеразы к промотору и называются они конститутивными генами. Существует еще одна группа генов, функционирование которых, а также скорость и продолжительность их транскрипции зависит от различных регулирующих факторов, стимулирующих или запрещающих соединение РНК-поли­меразы с промотором гена. Называют эти гены - регулируемые.

Гены-регуляторы под действием клеточных факторов обусловливают синтез регуляторных белков. Такие белки, соединяясь с определенными нуклеотидными последовательностями ДНК (оператором), могут способствовать или препятствовать присоединению РНК-полимеразы к промотору. В случае если белок регулятор не дает возможность ферменту присоединяться к промотору, он называется репрессором. В этом случае осуществляется негативный контроль транскрипции со стороны гена-ре­гулятора. В случае если белок-регулятор способствует присоединению РНК-полимеразы к промотору и началу процесса транскрипции, его называют белком-активатором, и осуществляется позитивный контроль со стороны гена-регулятора.

У эукариот не установлено полной оперонной организации генетического материала. Гены ферментов определенной метаболической цепи могут быть расположены в различных хромосомах. Они обычно не имеют общей системы регуляции в виде гена регулятора, оператора и промотора. Поэтому синтезированные в ядрах эукариот мРНК моноцистронны. Регуляция активности генов у эукариот сложнее, т. к. в этом процессе участвуют сразу несколько генов- регуляторов, т. е. регуляция транскрипции у эукариот является бикомбинативной. Например, в эукариот на молекуле ДНК имеется специальная область около промотора. Эта область имеет около 100 пар специальных нуклеотидов (препромоторный элемент). К этому участку молекулы присоединяется особый белок – фактор транскрипции. Это обеспечивает успешное присоединение ДНК-полимеразы II к промотору.

Ещё одна особенность генома эукариот – наличие специальных «усиливающих» сегментов ДНК – энхансеров. Они могут располагаться на большом расстоянии от промотора. Их функцией является участие в регуляции активности структурных генов. В свою очередь и препромоторный элемент, и энхансер регулируются соответствующими регуляторными белками. Некоторые белки регуляторы обладают координирующим влиянием на активность многих генов, т. е. они обладают плейотропным действием.

Геном эукариот также подчиняется регуляторным воздействиям со стороны эндокринной системы организма. Многие гормоны являются индикаторами транскрипции. В первую очередь это относится к стероидным гормонам, которые обратимо связываются с белками-рецепторами, переносящими их в ядро. Такой комплекс связывается со специфическим участком хроматина, ответственным за регуляцию генов. Например, действие тестостерона активизируют гены, определяющие развитие организма по мужскому типу. Ещё одна особенность регуляции активности генов эукариот связана с образованием хроматина – комплекса ДНК с белками. В таком виде гены в составе нуклеосом не способны к транскрипции. Поэтому необходимым условием является частичная декомпактизация хроматина и ослабление связей с гистоновыми белками. Однако полная нуклеосомная организация хроматина в ходе транскрипции не утрачивается.

Современное состояние теории гена. В результате исследований элементарных единиц наследственности сложились представления, носящие общее название теории гена. Основные положения этой теории следующие:

1. Ген – участок молекулы ДНК, имеющей определенную последовательность нуклеотидов. Представляет собой сложную функциональную единицу наследственной информации, состоящую из различных функциональных сегментов.

2. Разные гены имеют разный качественный и количественный состав нуклеотидов.

3. Каждый ген имеет определенное место (локус) в хромосоме.

4. Гены способны к рекомбинации (в процессе кроссинговера) и мутации, что обеспечивает изменчивость.

5. В хромосоме есть гены мРНК (структурные гены), гены рРНК и гены тРНК.

6. Среди структурных генов есть регуляторные гены, продукты которых регулируют работу других структурных генов.

7. Ген не принимает непосредственного участия в синтезе белков, он является «матрицей» для образования посредников – различных молекул РНК, непосредственно участвующих в синтезе.

8. Количество генов может удваиваться в процессе репликации, а затем распределяться в дочерние клетки в результате митоза или мейоза.

9. Ген может существовать в виде разных аллелей, определяющих варианты признаков.

10. Определенный структурный ген кодирует синтез одного полипептида. Отдельный белок может обуславливать определенный признак. Этим обусловлены моногенные признаки.

11. Клетка, орган или организм обладают многими сложными признаками, которые слагаются из взаимодействия многих генов – это полигенные признаки.

12. Действие гена строго специфично, т. к. ген может кодировать только одну аминокислотную последовательность и регулирует синтез только одного конкретного полипептида.

13. Некоторые гены обладают плейотропностью действия, определяя развитие сразу нескольких признаков. Например, синдром Марфана.

14. Дозированность действия гена заключается в зависимости интенсивности проявления признака (экспрессивность) от количества определенного аллеля. Например, многие заболевания в гетерозиготном состоянии проявляются слабее, чем в гомозиготном.

15. На активность гена может оказать влияние как внешняя, так и внутренняя среда.

16. Конститутивные гены – это гены, которые постоянно экспрессируются, т. к. белки, которые они кодируют, необходимы для постоянной клеточной деятельности, обеспечивают синтез белков «домашнего хозяйства» - белки рибосом, цитохромов, ферментов гликолиза, переносчиков ионов и др. Эти гены не требуют специальной регуляции.

17. Неконститутивные гены – это гены обычно неактивные, но экспессируются только тогда, когда белок, который они кодируют, нужен клетке. Эти гены регулируются клеткой или организмом. Эти белки обеспечивают дифференцировку, специфичность структуры и функции каждой клетки.

18. Молекулы ДНК способны к репарации, поэтому не всякие повреждения гена ведут к мутациям.

19. Генотип, будучи дискретным (состоящим из отдельных генов) функционирует как единое целое.