Репликация теломерных отделов ДНК.

1) Проблему сформулировал А.М.Оловников в 1971 году только для линейных ДНК – новые цепи оказываются укороченными с 5' концов.

2) Недорепликация ДНК ведет к старению клетки.

ДНК – полимераза только удлиняет 3' конец уже имеющегося полинуклеотида, а здесь такого конца просто нет – значит, новая цепь должна быть несколько короче старой. Образуются острые (50-65 н.п.) концы ДНК, которые обрезаются эндонуклеазами.

3) В среднем в 1 молекуле яд-ДНК 120 млн. н.п., значит, укорочение ДНК за одно клеточное деление составит ~ 0,00005%. Таким образом, если бы концы не восстанавливались, то через определенное количество делений хромосомы вообще исчезли бы!

Решение проблемы концевой недорепликации:

1) На концах хромосомной ДНК есть гексануклеотидная последовательность без информации:

5' ЦЦЦТАА → ТТАГГГ 3'

3' ГГГАТТ ← ← ААТЦЦЦ 5'

У 3' конца цепи 5' ТТАГГГ 3' эти повторы у эмбриона человека составляют 10-15 тысяч н.п. (0,02%). Если теряются эти буферные участки, то это не отражается на функции генома.

2) Удлинение теломер с помощью теломеразы (1984 г., Блэкберн, Грайдер).

Удлиняется старая цепь, более длинная (до обрезания острого конца!). К 3'-концу старой цепи пристраиваются несколько сотен ТТАГГГ - повторов, которые являются матрицей для образования еще одного фрагмента Оказаки.

3) Механизм ALT (альтернативный механизм) – без теломеразы у дрозофилы и некоторых раковых клеток – рекомбинация между теломерными участками разных хромосом и удлинение ДНК путем рекомбинации! Но роль ALT невелика!

Концевая недорепликация ДНК.

Известно, что ДНК-полимеразы, синтезируя дочернюю цепь ДНК, прочитывают родительскую цепь в направлении от ее 3 –конца к 5 -концу. Соответственно дочерняя цепь синтезируется в направлении 5' → 3'.

В противоположном направлении синтез цепи ДНК фермент катализировать не может. Кроме того, ДНК-полимераза начинает синтез только со специального РНК-праймера — короткой РНК-затравки, комплементарной ДНК. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются, а пропуски в одной из дочерних цепей ДНК заполняются ДНК-полимеразой. Однако на 3'-конце ДНК такой пропуск заполнен быть не может, и поэтому 3'-концевые участки ДНК остаются однотяжевыми, а их 5'-концевые участки — недореплицированными. Отсюда ясно, что каждый раунд репликации хромосом будет приводить к их укорочению. Понятно, что, прежде всего, должна сокращаться длина теломерной ДНК.

Этим-то и объясняется «лимит Хейфлика», так как после того, как длина теломерной ДНК становится угрожающе низкой, наступает период кризиса—неспособности клетки к дальнейшему делению, а затем и её смерть. Хотя в культурах клеток in vitro клетки и погибают от укорочения теломер, но для клеток in vivо нормального организма это практически невозможно. Так, согласно недавним наблюдениям Озавы (1997) 89% митохондриальной ДНК в митохондриях сердца 97- летнего старика содержали обширные делеции, критичные для репликации и транскрипции. Тем не менее, этот человек умер не от сердечной недостаточности, а от рака желудка. Нетрудно представить себе, что дальнейшее нарастание дисфункции митохондриальной ДНК всё же привело бы старика в недалёком будущем к смерти и это вряд ли имело отношение к укорочению ядерной ДНК.

Как отмечалось, первым на проблему «концевой недорепликации ДНК» обратил внимание А.М. Оловников в 1971 году. Он высказал гипотезу о том, что потеря концевых последовательностей ДНК вследствие их недорепликации ведет к старению клетки. Предполагалось, что процесс укорочения теломер и есть тот часовой механизм, который определяет репликативный потенциал «смертной» клетки, и когда длина теломер становится угрожающе короткой, этот механизм предотвращает дальнейшее деление клетки. А.М.Оловников предположил также, что в нестареющих клетках (а к ним кроме раковых относятся зародышевые, стволовые и другие генеративные клетки) должна существовать специализированная ферментативная система, которая контролирует и поддерживает длину теломерной ДНК.

Гипотеза А.М. Оловникова нашла убедительное подтверждение в последующие годы. Во-первых, было установлено, что теломеры нормальных (то есть обреченных на старение) клеток действительно укорачиваются на 50-60 нуклеотидных звеньев при каждом клеточном делении. Во-вторых, в 1984 году Э. Блэкберн и Э. Грайдер выделили фермент, который с помощью механизма, отличного от механизма реакций, лежащих в основе репликации ДНК, синтезирует теломерную ДНК. Этот фермент был назван теломеразой. Итак, основное назначение теломеразы — синтезировать повторяющиеся сегменты ДНК, из которых состоит Г-цепь теломерной ДНК. Таким образом, она относится к классу ДНК-полимераз, причем оказалось, что теломераза — это РНК-зависимая ДНК-полимераза или обратная транскриптаза. Ферменты этого класса, синтезирующие ДНК на РНК-матрицах, очень хорошо известны молекулярным биологам. Они закодированы и содержатся в ретровирусах (например, в вирусе иммунодефицита человека, вызывающем заболевание СПИДом) и служат для синтеза ДНК-копий их геномов, который в ретровирусе представлен РНК. В клеточном геноме обратные транскриптазы закодированы в ретротранспозонах.

РНК, используемая теломеразой для синтеза теломерной ДНК в качестве матрицы, входит в состав этого фермента. В этом уникальность теломеразы: на сегодня это единственная известная РНК-содержащая обратная транскриптаза. Теломеразные РНК у разных организмов сильно различаются по длине и структуре.

Теломеразы простейших содержат РНК длиной в 150—200 нуклеотидных остатков (н.о.), длина теломеразной РНК человека — 450 н.о., в то время как теломераза дрожжей содержит аномально длинную РНК (около 1300 н.о.).

Матричный участок представлен в теломеразной РНК только один раз. Его длина не превышает длину двух повторов в теломерной ДНК, которые он кодирует и которым он комплементарен.

Так как теломераза синтезирует сегменты ДНК, повторяющиеся много раз, используя только один сегмент своей РНК, она должна обладать способностью периодически (после завершения синтеза каждого повтора) перемещать (транслоцировать) матричный участок в район 3'-конца синтезируемой теломерной ДНК. Источником энергии для такого перемещения, по-видимому, служит сама реакция синтеза цепи теломерной ДНК, поскольку дезоксинуклеозидтрифосфаты — субстраты этой реакции — высокоэнергетические вещества.

На первой стадии теломераза находит З'-конец теломерной ДНК, с которым часть матричного участка теломеразной РНК образует комплементарный комплекс. При этом теломераза использует З'-конец хромосомной ДНК в качестве праймера. Далее наступает очередь РНК-зависимой ДНК-полимеразной активности теломеразы.

Рис.10. Механизм действия теломеразы

Она обеспечивается специальной субъединицей теломериразы, которая по устройству своего каталитического центра во многом сходна с обратными транскриптазами ретровирусов и ретротранспозонов. Когда синтез ДНК-повтора заканчивается, происходит транслокация, то есть перемещение матрицы и белковых субъединиц фермента на заново синтезированный конец теломерной ДНК, и весь цикл повторяется вновь (рис.10).

Это схематичное представление является весьма условным, так как для построения теломер требуется еще много субъединиц, например, отвечающих за нахождение 3'-конца ДНК, или субъединицы, отвечающие за транслокацию, и т.д.

Теломераза, рак и старение.Рассмотрим данные о длине теломерной ДНК и активности теломеразы в различных клетках человека.

Высокая теломеразная активность наблюдается в половых клетках человека в течение всей его жизни (табл.1). Соответственно их теломеры состоят из наибольшего числа ДНК-повторов и содержат все необходимые белки для нормальной репликации клеток.

Табл.1. Теломеразная активность различных клеток

Аналогичная ситуация наблюдается и для стволовых клеток, которые делятся неограниченно долго. Однако у стволовой клетки всегда есть возможность дать две дочерние клетки, одна из которых останется стволовой («бессмертной»), а другая вступит в процесс дифференцировки. Благодаря этому стволовые клетки служат постоянным источником разнообразных клеток организма. Например, стволовые клетки костного мозга дают начало гемопоэзу — процессу образования клеток крови, а из базальных клеток эпидермиса происходят разнообразные клетки кожного покрова. Как только потомки половых или стволовых клеток начинают дифференцироваться, активность теломеразы падает и их теломеры начинают укорачиваться. В клетках, дифференцировка которых завершена, активность теломеразы падает до нуля, и с каждым клеточным делением они с неизбежностью приближаются к состоянию сенесенса (перестают делиться). Вслед за этим наступает кризис, и большинство клеток погибает. Эта картина характерна для подавляющего большинства известных культур клеток эукариот. Однако и здесь есть редкие, но важные исключения: теломеразная активность обнаруживается в таких «смертных» клетках, как макрофаги и лейкоциты.

Недавно было установлено, что нормальные соматические клетки потому лишены теломеразной активности, что в них полностью подавлена экспрессия гена ее каталитической субъединицы (обратной транскриптазы). Другие же составляющие теломеразы, включая теломеразную РНК, образуются в этих клетках, хотя и в меньших количествах, чем в их «бессмертных» прародителях, но постоянно. Открытие этого важного факта Дж. Шеем, В. Райтом и их сотрудниками и стало основой для сенсационной работы по преодолению «лимита Хейфлика».

Сравнительно небольшая длина теломер у большинства раковых клеток наводит на мысль о том, что они происходят из нормальных клеток, достигнувших предкризисного состояния. Это состояние характеризуется нарушением регуляции многих биохимических реакций. В таких клетках происходят многочисленные хромосомные перестройки, которые в том числе ведут и к злокачественной трансформации. Большинство этих клеток погибают, но в части из них в результате случайных мутаций может активироваться постоянная экспрессия генов теломеразы, которая будет поддерживать длину теломер на уровне, необходимом и достаточном для их функционирования.

Некоторое время вызывал недоумение тот факт, что примерно пятая часть проанализированных раковых опухолей и клеток вообще не содержала активной теломеразы. Оказалось, однако, что длина теломер в них поддерживается на должном уровне. Таким образом, в этих клетках действует другой (не теломеразный, а скорее рекомбинационный) механизм образования теломерной ДНК. Иными словами, такие клетки находятся в том же ряду исключений из правила, что и дрозофила.

В последнее время проводится много работ, аналогичных работе Дж. Шея, В. Райта. Были сообщения о том, что клетки с искусственно активированной теломеразой преодолели 220 циклов деления. Последние сообщение пришло из Юго-Западного Медицинского Центра в Далласе; в нём говорится, что уже 220 поколений клеток преодолели 70-75 циклов деления.

Репарация и заболевания человека как результат нарушения репарации.Для сохранения основных характеристик клеток и организмов данной популяции необходимо точное сохранение структуры и стабильности функции генетического материала на протяжении тысяч и милли­онов лет, несмотря на действие различных мутагенных факторов. Существует несколько причин высокой стабильности структуры и функций ДНК. Во-первых, это высокая химическая стабильность самой молекулы ДНК, а во-вторых, это наличие cпeциaльных мexaнизмoв репарации возникающих изменений. Широкий набор различных репликационных ферментов осуществляет непрерывный «осмотр» ДНК и удаление из нее поврежденных нуклеотидов. Способность клеток к исправлению повреждений в молекулах ДНК получила название репарации (лат.: reparatio — восстановление). Наследственная информация представлена в ДНК в виде цепей двойной спирали ДНК. Благодаря этому случайное повреждение в одной из цепей может быть исправлено репликационным ферментом, и данный участок цепи восстановлен в своем нормальном виде за счет информации, содержащейся в неповрежденной цепи.

Классификация репараций. По времени осуществления в клеточном цикле различают дорепликативную, репликативную и пострепликативную репарацию.

Дорепликативная репарация. Это процесс восстановления по­врежденной нити ДНК до ее удвоения. В простейших случаях разрывы могут быть воссоединены ферментом лигазой. В других случаях ис­пользуется полная ферментативная система эксцизионной или неэксцизионной репарации.

Репликативная репарация. Это совокупность процессов восста­новления ДНК в ходе репликации. При этом поврежденный участок удаляется в ходе репликации в зоне роста цепи. В обеспечении высокой точности репликации большая роль принадлежит механизму само­коррекции, осуществляемому ДНК-полимеразой или тесно связанной с ней ферментом эндонуклеазой. Этот процесс связан с определением ошибочно включенного в цепь нуклеотида, отщеплением его и заменой на соответствующий. В результате этого частота ошибок снижается в10 раз (с 10-⁵до 10-⁶ ).

Пострепликативная репарация. Ее механизм точно не изучен. При пострепликативной репарации происходит вырезание повреж­денного участка, что изменяет ген. При этом клетка может сохранять жизнеспособность и передавать дефектную ДНК дочерним клеткам. Предполагают возможность наличия различных вариантов синтеза ДНК на поврежденной матрице.

По механизмам осуществления репарация подразделяется на: неэксцизионную репарацию и эксцизионную (вырезающую) репарацию.

Неэксцизионная репарация. Фоторепарация. В результате ультрафиолетового облучения целостность молекул ДНК нарушается, так как в них возникают димеры, т. е. сцепленные между собой соседние пиримидиновые основания. Димеры могут формироваться между двумя тиминами, тимином и цитозином, двумя цитозинами, тимином и урацилом, двумя урацилами. Однако, облученные клетки, на свету выживают гораздо лучше, чем в темноте. После тщательного анализа причин этого явле­ния, установлено, что в поврежденных клетках на свету происходит репарация ДНК (фоторепарация). Она осуществляется специальным ферментом ДНК-фотолигазой, активирующейся квантами видимого света. Фермент соединяется с поврежденной ДНК, разъединяет возникшие в димерах связи и восстанавливает целостность нити ДНК. Фотоактивируемый фермент ДНК-фотолигаза не является видоспецифичным, т. е. действует на разные виды ДНК. В качестве кофермента в нем имеется цианокобаламин (вит. В|2), поглощающий кванты видимого света и передающий энергию молекуле фермента. При неэксцизионной световой репарации исправляются поврежде­ния, возникшие только под воздействием ультрафиолетовых лучей. На ранних стадиях эволюции живых организмов, когда отсутствовал озоновый экран, задерживающий большую часть потока губительных для организмов солнечных ультрафиолетовых лучей, фоторепарация играла особенно важную роль.

Деалкилирование гуанинов. Если структура ДНК изменена в ре­зультате присоединения к гуанину метиловых или этиловых групп, то репарацию осуществляет фермент гуанин-алкилтрансфераза. Этот фермент отделяет указанные группы и присоединяет их к себе, после чего структура поврежденного участка ДНК восстанавливается.

При эксцизионной (вырезающей) репарации устраняются по­вреждения, появившиеся под влиянием ионизирующей радиации, химических веществ и других факторов. Это основной тип репарации, который обнаружен как у прокариот, так и в клетках эукариот (рис.11). Ме­ханизм эксцизионной репарации ДНК отличается тем, что не только разрезаются димеры (как при световой), но и вырезаются большие участки молекулы ДНК (до нескольких сотен нуклеотидов). Видимо могут удаляться целые гены, после чего происходит репаративный комплементарный матричный синтез с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Следствия нарушения процесса репарации. К настоящему времени обнаружено несколько тяжелых врожден­ных заболеваний из-за нарушения процесса репарации.

Заболевания у человека, которые вызываются генетическими нарушениями системы эксцизионной репарации: 1) пигментная ксеродерма, 2) синдром Кокейна, 3)трихотиодистрофия и 4) синдром преждевременного старения.

Пигментная ксеродерма, заболевание, причиной кото­рого является редко встречающаяся рецессивная аутосомная мутация, вследствие чего у таких детей

Рис.11. Схема эксцизионной репарации ДНК по удалению Т-Т димера: А. Под действием УФ-облучения в цепи ДНК может возникнуть мутация (димер Т-Т). В. Соответствуюшая эндонуклеаза узнает нарушение и вырезает участок поврежденной цепи ДНК. С. Удаление из поврежденной цепи обширного участка (включающего димер) ДНК-полимеразой, обладающей экзонуклеазной активностью. D. Матричный синтез вы­резанного участка цепи с помощью ДНК-полимеразы и соединение его с неповрежденным участком. 1 - эндонуклеаза; 2 - ДНК-полимераза.

отсутствует один из ферментов репарации ДНК. Кожа больных пигментной ксеродермой обладает повышенной чувствительностью к дневному свету, что проявляется в виде фотодерматозов, включая рак кожи. В ряде случаев отмечены аномалии нервной системы, причиной которых являются мутации в одном из семи генов. Однако описаны больные с классическими симптомами пигментной ксеродермы, но с ненарушенной системой NER. Для клеток этих больных характерны изменения в так называемой пострепликативной репарации.

Больным с синдромом Кокейна присущи нарушения роста, умственная отсталость, катаракты, повышенная чувствительность к свету с сопутствующими дерматозами. Обнаружены мутации в двух группах генов, приводящие к этому заболеванию.

У больных трихотиодистрофией проявляются смешанные симптомы двух первых заболеваний.

Синдром преждевременного старения возникает, как и пигментная ксеродермия, при нарушении репарационной системы, которая устраняет димеры тимина, образующиеся при УФ-облучении.

Данный синдром подтверждает предположение о том, что и нормальное старение связано с ослаблением деятельности систем репарации ДНК, равно как и других защитных систем.

На внутриклеточном уровне существуют такие защитные системы: репарация ДНК; теломеры и теломераза; антиоксидантная система (обезвреживающая свободные радикалы); система шаперонов (белков теплового шока), восстанавливающая третичную структуру белков при ее нарушении вследствие, например, локального всплеска температуры; метилирование ДНК.

Генетическая рекомбинация. У эукариот рекомбинацию в узком смысле слова называют кроссинговером, т.е. рекомбинацией генов, локализованных в гомологичных хромосомах.

В профазе I мейоза на стадии диплотены у многих организмов хорошо различимы характерные фигуры, образуемые гомологичными хромосомами - хиазмы. Еще в 1909 г. Ф. Янсенс предположил, что образование хиазм связано с обменами гомологичными участками гомологичных хромосом. Позднее Т. Морган связывал хиазмы с кроссинговером. В 1931г. Харрист Крейтон и Барбара Мак-Клинток решили эту проблему для кукурузы, а Курт Штерн - для дрозофилы. Они показали, что в основе кроссинговера лежит реальный обмен участками гомологичных хромосом по типу разрыв-слияние. Рядом ученых (К. Бриджес, И. Андерсон, 1925г. - на дрозофиле; Дж. Тейлор, 1967г. - на кузнечике и др.) было доказано, что кроссинговер происходит в профазе мейоза на стадии 4 нитей. В результате этого образуются хиазмы, которые удобнее всего наблюдать на стадиях диплотены и диакинеза.

Тип кроссинговера в эукариот:

1. Равный – «обычный», на котором базируется хромосомная теория Моргана.

2. Неравный - происходит редко, при неравной конъюгации. При этом в одной хромосоме оказываются два одинаковых гена (дупликация), а в другой – ни одного из пары (делеция).

Митотический кроссинговер был обнаружен в 1936г. К. Штерном у дрозофилы при исследовании окраски тела и щетинок. Его частота на 2-3 порядка меньше мейотического.

Факторы, влияющие на кроссинговер:

I) излучения (УФЛ, рентген-лучи, γ-лучи);

2) многие химические агенты;

3) увеличение и уменьшение температуры;

4) возраст и др.

Частота кроссинговера находится под строгим генетическим контролем. Было показано, что кроссинговер не происходит у самцов D.melanogaster, а также у самок тутового шелкопряда.

Кроссинговер — это процесс обмена соответствующими участками ДНК между несестринскими хроматидами гомологичных хромосом. При этом происходит обмен аллельными генами, что образует их новые комбинации в гомологичных хромосомах. Этот процесс обеспечивает перекомбинацию отцовских и материнских аллелей в группах сцепления. Расхождение гомологичных хромосом в разные клетки приводит к образованию разных по аллельному составу гамет. Случайное расположение хромосом в плоскости клетки и последующее их расхождение в анафазе 1 обеспечивает рекомбинацию родительских групп сцепления в гаплоидном наборе гамет. Каждая гамета является уникальной в отношении аллельного состава. Разным аллельным составом гамет объясняется то, что потомки никогда полностью не похожи друг на друга или родителей. Хромосомы, образовавшиеся в результате взаимообмена сегментами, известны как рекомбинантные хромосомы, а хромосомы, оставшиеся интактными, называются нерекомбинантными.

Молекулярный механизм кроссинговера. В этом процессе участвуют две молекулы ДНК несестринских хроматид.

Рис.12. Схема одноцепочного обмена между ДНК несестринских хроматид

Суть молекулярного процесса сводится: а) к разрыву двух длинных линейных молекул ДНК в одной или нескольких частях; б) соединению разорванных цепей молекул ДНК соседних хроматид в другом порядке; в) обмену нуклеотидными последовательностями; г) последующему разрыву и восстановлению целостности цепей молекул ДНК. Процесс завершается расхождением хромосом. В результате — цепи контактировавших молекул ДНК имеют измененный состав нуклеотидов.

В процессе участвуют десятки разнообразных ферментов. Кроссинговер как механизм рекомбинации эффективен только в том случае, когда соответствующие гены гомологичных хромосом представлены разными аллелями. Одинаковые группы сцепления не дают новых сочетаний.

Типы кроссинговера. В зависимости от количества появившихся хиазм, могут быть рассмотрены следующие типы кроссинговера:

одиночный кроссинговер. В этом случае образуется только одна хиазма, что ведет к обмену только одним участком ДНК гомологичных хромосом. Это наиболее распространенный тип кроссинговера (рис.12);

двойной кроссинговер. В этом случае образуются две хиазмы. Они могут появляться как между одними и теми же несестринскими хроматидами, так и между разными несестринскими хроматидами. Этот тип кроссинговера приводит к обмену двумя участками ДНК гомологичных хромосом;

множественный кроссинговер. В этом случае образуется более двух хиазм (перекрестов) между несестринскими хроматидами гомологичных хромосом. Далее они могут быть классифицированы как тройные (3 хиазмы), четвертные (4 хиазмы) и т. д.

Значение кроссинговера. Кроссинговер — широко распространенное явление. Он происходит практически у всех организмов, размножающихся половым путем. Этот процесс является молекулярной основой комбинативной изменчивости. В результате рекомбинации генов могут появляться новые полезные признаки и их сочетания. Поэтому кроссинговер имеет большое значение для выживания и размножения. Этот процесс также увеличивает генетическое разнообразие потомства, что очень важно для приспособления и эволюции. Определение частоты кроссинговера лежит в основе картирования генов хромосом, т. е. определения места расположения различных генов в хромосоме.

Формы обмена генетическим материалом у бактерий.Прокариоты (бактерии, цианобактерии) - гаплоидные организмы. Для них нет понятия доминантность- рецессивность, они не имеют ни митоза, ни мейоза. С 1944г. по 1952г. у бактерий были расшифрованы процессы, приводящих к объединению и рекомбинации генетического материала.

Помимо основного механизма передачи генов — по наследству (по вертикали), у бактерий существуют следующие формы обмена генетическим материалом по горизонтали, т. е. между отдельными особями в популяции клеток: трансформация, трансфекция, трансдукция, конъюгация и сексдукция.

Трансформация — перенос генетического материала, заключающийся в том, что бактерия-реципиент захватывает (поглощает) из внешней среды фрагменты чужеродной ДНК. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Индуцированная (искусственно получаемая) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из культур тех бактерий, генетические признаки которых стремятся передать исследуемой культуре. Спонтанная трансформация происходит в естественных условиях и проявляется в возникновении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду вследствие их лизиса или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Как спонтанная, так и индуцированная трансформация сводится, по сути, к поглощению трансформирующей ДНК и образованию рекомбинантов, причем спонтанная трансформация может происходить в результате взаимного обмена ДНК. Эффективность индуцируемой трансформации во многом зависит от физиологического состояния клеток-реципиентов. Они должны находиться в состоянии своеобразной компетентности для этого процесса. Предполагается, что в фазе компетентности происходят значительные изменения поверхностных слоев клетки, которые способствуют поглощению ДНК. В частности, аутолитические ферменты клетки растворяют клеточную стенку в тех участках, где происходит ее синтез. При этом мезосомы через образовавшиеся отверстия соприкасаются с внешней средой, адсорбируют и втягивают внутрь клетки трансформирующую ДНК, где она и вступает в рекомбинацию с ДНК реципиента. В результате этого образуется мерозигота, клетка делится, и ее потомки наследуют признаки, полученные от донора и реципиента.

Однако в других случаях поглощенные фрагменты ДНК разрушаются нуклеазами клетки-реципиента, и трансформации не происходит. Ее эффективность зависит также от размеров трансформирующей ДНК: высокомолекулярная ДНК поглощается труднее, чем менее крупные ее фрагменты. Способность к трансформации обнаружена у ряда родов бактерий, но, по-видимому, роль ее в обмене генетическим материалом среди бактерий в естественных условиях менее существенна, чем роль других механизмов. Дело в том, что у многих бактерий имеются особые системы рестрикции и модификации. Эти системы модифицируют свою ДНК (чаще всего путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК, если она подобным образом не модифицирована, с помощью особых ферментов — рестрикционных эндонуклеаз.

Эффективность метода генетической трансформации во много раз повышается в том случае, если смесь ДНК и трансформируемых клеток с помощью специального прибора подвергнуть обработке электрическим импульсом. Метод электротрансформации является универсальным, он применим к любым видам бактерий. С помощью этого метода осуществлена трансформация более 100 видов бактерий, и он может стать важным инструментом получения ценных рекомбинантных штаммов бактерий.

Трансфекция — вариант трансформации бактериальных клеток, лишенных клеточной стенки, осуществляемый вирусной (фаговой) нуклеиновой кислотой. С помощью трансфекции удается вызвать у таких бактерий (без клеточной стенки) вирусную инфекцию. Трансфекцию можно осуществить и с другими (не бактериальными) клетками, если ввести в них чужеродную ДНК, способную рекомбинировать с ДНК этих клеток, или способную воспроизводить вирионы, или самостоятельно реплицироваться.

Трансдукция — перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают трансдукцию неспецифическую и специфическую. Неспецифическая трансдукция — случайный перенос фрагментов ДНК от одной бактериальной клетки к другой.

Специфическая трансдукция осуществляется только умеренными фагами, обладающими способностью включаться в строго определенные участки хромосомы бактериальной клетки и трансдуцировать определенные гены.

Конъюгация - процесс обмена генетическим материалом (хромосомным и плазмидным), осуществляемый при непосредственном контакте клеток донора и реципиента. Этот процесс контролируется только конъюгативными плазмидами, имеющими совокупность генов, называемую tra-опероном (tra — от англ. transfer — перенос). Этот оперон контролирует синтез аппарата переноса, конъюгативную репликацию и явление поверхностного исключения. Аппаратом переноса являются специальные донорные ворсинки, с помощью которых устанавливается контакт между конъюгирующими клетками. Донорные ворсинки представляют собой длинные (1-20мкм) тонкие трубчатые структуры белковой природы с диаметром внутреннего отверстия около 3 нм. Число донорных пилей у каждой F+-клетки невелико и, очевидно, соответствует числу копий конъюгативной плазмиды в клетке. Донорные ворсинки обнаруживают с помощью донорспецифических фагов, которые, адсорбируясь на них, проникают в клетку и вызывают ее лизис. Для каждой группы конъюгативных плазмид существуют свои донор специфические фаги. Ворсинки выполняют следующие функции: 1) с их помощью устанавливается контакт между донорной и реципиентной клетками; 2) они облегчают перенос нити ДНК (она, вероятно, протаскивается через ворсинку); 3) стягивают спаривающиеся клетки, что повышает эффективность конъюгации.

Процесс конъюгации протекает через следующие стадии: установление контакта между донором и реципиентом, протаскивание нити ДНК от донора к реципиенту, достройка перенесенной нити ДНК комплементарной ей нитью в реципиентной клетке и рекомбинация между переданной хромосомой (ее фрагментами) и хромосомой клетки-реципиента (рис.13), размножение мерозиготы и образование клеток, несущих признаки донора и реципиента.

Рис.13. Схема рекомбинации у бактерий

Сущность поверхностного исключения заключается в том, что под контролем tra-генов синтезируются белки наружной мембраны, препятствующие (исключающие возможность) проникновению в клетку, несущую плазмиду, другой, но близкородственной ей плазмиды, или подавляющие конъюгативную репликацию ее ДНК.

Конъюгативная репликация переносимой нити хромосомной или плазмидной ДНК осуществляется также под контролем плазмидных генов. Классическим примером конъюгативной плазмиды является половой фактор, или F-плазмида (F — от англ. fertility — плодовитость). Эта плазмида представляет собой двунитевую кольцевидную молекулу ДНК, состоящую из 94,5 тысяч п. н. Главная функция этой плазмиды — контроль конъюгации у бактерий кишечной группы. Ее tra-оперон содержит больше тридцати генов, которые контролируют процесс конъюгации. Эта плазмида может находиться как в автономном состоянии, так и интегрироваться в хромосому клетки. Находясь в автономном состоянии, она контролирует только собственный перенос, при котором F-клетка (клетка, лишенная F-плазмиды) превращается в F+-клетку (клетку, содержащую F-плазмиду), F-плазмида может интегрироваться в определенные участки бактериальной хромосомы, в этом случае она станет контролировать конъюгативный перенос хромосомы клетки. При этом одна из нитей ДНК хромосомы в месте интеграции F-плазмиды разрезается, и ее 5'-конец через донорный мостик начинает протягиваться в клетку-реципиент. Репликация ДНК в этом случае протекает по принципу «крутящегося» кольца. Таким образом, конъюгация начинается с установления контакта между донором и реципиентом с помощью донорной ворсинки. Последняя смыкается с рецептором клеточной мембраны клетки-реципиента.

Нередко такой контакт устанавливается не только между двумя клетками, а между многими клетками, образуя агрегаты спаривания. Предполагают, что нить ДНК в процессе конъюгации протаскивается через канал донорной ворсинки. Поскольку донорный мостик является непрочным, процесс конъюгации может в любой момент прерваться. Поэтому при конъюгации может переноситься или часть хромосомы, или реже, полная хромосома. С помощью F-плазмид частота переноса генов между бактериями существенно возрастает. Поэтому клетки, у которых F-плазмида итегрирована в хромосому, обозначают как клетки Нfг (Нfг — от англ. high frequency recombination — клетки, обеспечивающие высокую частоту рекомбинаций).

В некоторых случаях интегрированная в хромосому F-плазмида может из нее исключаться и, подобно умеренному фагу, «выхватывать» из хромосомы ее ген или даже целую группу генов. Такая плазмида, содержащая в своей ДНК часть генов хромосомы клетки, называется F′-плазмидой.

Сексдукция — перенос генетического материала между бактериальными клетками, осуществляемый F′-плазмидой с помощью механизма, аналогичного специфической трансдукции.

Заключительным этапом при любой форме обмена генетическим материалом является рекомбинация между привнесенной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. Если переносится одна нить ДНК, то она вначале достраивается комплементарной ей нитью; рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Различают общую рекомбинацию, сайт-специфическую рекомбинацию и рекомбинацию, контролируемую транспонируемыми элементами. Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация происходит за счет наличия специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК. Ее примером является специфическая рекомбинация между умеренным фагом λ и хромосомой Е.соli. Как в бактериальной хромосоме, так и в ДНК фага λ имеются специфические участки (аttВ и аttP соответственно), между которыми и происходит сайт-специфическая рекомбинация. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном rесА.

Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, тоже являются сайт-специфическими, но специфичность этих сайтов связана с особыми нуклеотидными последовательностями, и эта форма рекомбинации не зависит от rесА-гена.

Главным генетическим детерминантом всех путей рекомбинации является ген rесА. Его повреждение полностью исключает возможность образования рекомбинантов. Основной путь rесА-рекомбинации осуществляется с участием продуктов генов rесВ и rесС (они кодируют синтез эндонуклеазы V).

В случае мутации по rесВ и rесС выход рекомбинантов составляет около 20% от rеc+. Однако эти мутации могут быть исправлены путем механизмов супрессии в двух генах: sbсА и sbсВ. Супрессии sbсА открывают дополнительный путь рекомбинации через ген rесЕ (его продукт — экзонуклеаза VIII). Супрессии sbсВ реализуют рекомбинации через ген rесЕ (структурный ген экзонуклеазы I). Таким образом, генетический контроль рекомбинаций носит сложный характер.

Изучение его механизма — одна из центральных задач молекулярной генетики. Особый интерес представляет изучение механизма гомологической рекомбинации. Это определяется перспективами развития молекулярной медицины. Одной из важнейших стратегических задач, поставленных перед программой «Геном человека», является обнаружение изменений первичной структуры ДНК, которые приводят к нарушению функции генов и, как следствие этого, к развитию наследственных заболеваний человека. Идеальным методом лечения их является генотерапия, основанная на замене поврежденного («больного») гена здоровым в месте его локализации на хромосоме. Такая замена может быть осуществлена только с помощью гомологической рекомбинации, механизмы которой у бактерий и эукариот, очевидно, во многом сходны. У бактерий выявлены два способа такой рекомбинации, осуществляемых двумя типами рекомбиназ: АТФ-зависимым белком RесА и АТФ-независимой ренатуразой. Соответственно, и у эукариот обнаружены АТФ-зависимые и АТФ-независимые ДНК-трансферазы, среди которых найдены белки, функционально сходные с RесА-белком бактерий.

Решающая роль в гомологической рекомбинации у бактерий, как указано выше, принадлежит гену rесА. Его продукт — белок RесА с м.м. 38 кД — обладает рядом уникальных функций: 1) он прочно связывается с одиночными нитями ДНК; 2) способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; 3) он одновременно может присоединяться и к двойной спирали ДНК, и к одиночной нити и удерживать их вместе; 4) он обладает свойством ДНК-зависимой АТФ-азы. Благодаря этому свойству обеспечивается серия конформационных превращений, которые обусловливают превращение трехнитевого комплекса с неспаренными основаниями в трехнитевый комплекс со спаренными основаниями. С помощью этой реакции происходит прямое комплементарное взаимодействие между одиночной нитью ДНК и двойной спиралью — главное событие в процессе рекомбинации. Энергия гидролиза АТФ RесА-белком используется последним для продвижения одиночной нити вдоль двойной спирали ДНК с целью нахождения того ее участка, который имеет гомологичную последовательность нуклеотидов, необходимую для замыкания водородных связей, т. е. для спаривания. Для объяснения механизма гомологической рекомбинации предложены разные модели. В соответствии с наиболее популярной моделью, рекомбинация инициируется с помощью однонитевого разрыва в одной из двух гомологичных молекул ДНК, вызываемого эндонуклеазой, которая кодируется генами rесВ и rесС, Образующийся при этом конец (3'- или 5'-конец) однонитевой ДНК (онДНК) атакует двойную спираль другой молекулы ДHК, отыскивая в ней гомологичный участок, и образует временную трехнитевую структуру. В результате спаривания атакующей молекулы онДНК с комплементарной нитью другой молекулы ДНК происходит выталкивание ее освобождающейся нити, которая в свою очередь спаривается с комплементарной нитью другой молекулы ДНК. Во время этих событий часто наблюдается удаление некоторого количества нуклеотидов, репарация образующейся бреши и лигирование ДНК, но, в конечном счете, образуется предсказанная Р. Холидеем полухиазма [от греч. chiasmos — расположение в виде греческой буквы Х (хи)]. В случае обмена с перекрещиванием нитей обе гомологичные спирали ДНК после начального этапа спаривания удерживаются вместе благодаря перекрестному обмену нитями из имеющихся четырех — по одной нити от каждой спирали. Структура, образующаяся при этом, обладает двумя важными свойствами:

1. Точка обмена между двумя гомологичными спиралями, т. е. место, где скрещиваются две их нити, может быстро мигрировать по спирали. Этот процесс получил название миграции ветвей. Миграция может значительно увеличивать области спаривания между двумя взаимодействующими нитями, изначально принадлежавшими разным молекулам ДНК.

2. Эта структура, благодаря вращению составляющих ее элементов относительно друг друга, может находиться в различных изомерных формах. Изомеризация изменяет положение двух пар нитей: две ранее перекрещивающиеся нити становятся неперекрещивающимися, и наоборот. Для прекращения процесса спаривания в каждой из двух нитей должен произойти разрыв. Если он произойдет до изомеризации, у каждой спирали будет заменена только одна из нитей и только на коротком отрезке. Если же разрыв произойдет после изомеризации, наступит полный кроссинговер.

Фермент ренатураза кодируется у E.соli геном rесЕ. Он относится к классу «гомологических ДНК-синаптаз», которые, в отличие от RесА-белка, не обладают ДНК-трансферазной активностью и не зависят от АТФ. Эти белки участвуют в реакциях гомологической рекомбинации, индуцированных двунитевыми разрывами ДНК.

Ген rесА участвует не только в процессе рекомбинации, его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и ряда других жизненно важных для бактерий функций. Рецессивные мутации в этом гене неизбежно отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность объединена в единую SOS-систему (от англ. SOS — сигнал бедствия — save our souls — спасите наши души или save our ship —спасите наш корабль).

Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта rесА-гена. SOS-система срабатывает после любых воздействий на ДНК агентами, которые повреждают ее структуру, или нарушают нормальный процесс ее репликации, или нарушают другие функции. Поэтому rесА-гену принадлежит ведущая роль в обеспечении самозащиты генетической системы бактериальной клетки.

Генная конверсия. Еще один тип изменчивости связан с внутренними из­менениями в повторах - это генная конверсия. Мы проиллюстрируем ее следующим примером. Представим себе два варианта одного и того же текста (А и Б), отличающиеся несколькими заменами слов или фраз. Можно создать третий вариант, скроив из А и Б, как при реципрокной рекомбинации, тексты-гибриды А-Б и Б-А. Но при этом исходные варианты восстановить по ним не удастся. Можно скопировать из Б отдельный фрагмент и, сохранив вариант Б, вставить этот фрагмент на место соответствующего участка в А, создав гибрид А - Б - А. Итак, при обмене между двумя гомологичными последователь­ностями А и Б (которые мы будем считать идентичными, кроме нескольких замен нуклеотидов, позволяющих их различать) Б передает в А всю или часть своей последова­тельности, но сам при этом остается в прежнем состоянии. Результат конверсии, следовательно, состоит в том, что пара (А, Б) «конвертируется» в (А-Б-А, Б) (рис.14). Существование подобного механизма было продемонстрирова­но в 1970-1980 гг. в генетическом плане на грибах Ascobolus, а в 1982 г. в молекулярном плане - на дрожжах Saccharomyces cerevisiae.

Итак, генная конверсия характеризуется однонаправ­ленным переносом избыточного и несколько отличного ге­нетического материала (если бы он был идентичным, его нельзя было бы отличить). Одна последовательность играет роль донора, другая- реципиента, причем последова­тельность- донор в ходе конверсии не изменяется. Проде­монстрировать генную конверсию высших организмов достаточно трудно, поскольку их генетический анализ очень не прост. Тем не менее, видимо, именно генной конверсией объясняется та изменчивость, которую наблюдали в генах иммуноглобулинов и в генах гистосовместимости. Механизм генной конверсии представляется общим и работает как между двумя аллелями, т.е. в рамках фундаментальной избыточности любой диплоидной клетки, так и на уровне семейств по­второв, как кодирующих, так и некодирующих, т.е. между неаллельными участками. Этот механизм приводит одновременно к двум последствиям: к большей изменчиво­сти (внедрение в ген А гомологичной последовательности, заимствованной из гена Б) и к гомогенизации последова­тельностей, позволяющей членам мультигенных семейств оставаться в соседстве друг с другом.

Роль этих генетических феноменов, связанных с избы­точностью ДНК в клетках, весьма существенна. Если при этом заметить, что ряд последовательностей обладает спо­собностью «транспонироваться» из одного участка хромосомы в дру­гой, то мы приходим к возможностям, доселе не подозре­ваемым: делеции, сжатие или расширение семейств последовательностей, образование гибридных генов путем ре­комбинации или конверсии, изменение локализации некоторых последовательностей и еще многое другое. Конечно, события такого рода относительно редки. Но все-таки они существуют, проявляясь внезапными скачками в «мута­ционной» эволюции генома. А структура последнего в ито­ге теряет стабильность, позволившую в свое время Менделю открыть свои знаменитые законы. В какой же мере эволюция генома нарушает эти законы?

Рис.14. Неравный кроссинговер и генная конверсия

При конъюгации хромо­сом в процессе мейоза между неаллелъными генами из мулътигенного семейства может проис­ходить рекомбинация по одному из двух механизмов: в результа­те неравного кроссинговера или в результате генной конверсии. При неравном кроссинговере (вверху) образуются гибридные гены (АВ и В А) с общим не­равным распределением генов по гомологичным хромосомам. При такой рекомбинации одна из парных хромосом даже теряет участок ДНК. Последователь­ность подобных кроссинговеров приводит к увеличению и умень­шению числа генов. В случае ген­ной конверсии (внизу) происхо­дит передача части гена (напри­мер, В) в другой гомологичный ген с образованием химеры ABA. Поскольку во второй хромосоме ген В остается неизменным, предполагают, что такая передача происходит при мейозе во вре­мя синтеза ДНК. Итог генной конверсии- сохранение исходных генов в одной из хромосом (А и В) и «конверсия» гена во второй хромосоме (ABA и В). Оба этих механизма, достаточно частые и распространенные, лежат в ос­нове перестроек последователь­ности ДНК, по праву считаясь сегодня двигателем эволюции.