К ВОПРОСУ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ПРЕПАРАТА АНТИСЕПТИК СТИМУЛЯТОР ДОРОГОВА АСД-2

В настоящее время продолжает оставаться актуальной задача разработки обоснованных методов определения показателей качества препарата АСД–2 (в дальнейшем – препарата), являющегося водной фракцией конденсата продуктов термического разложения мясокостной муки и широко применяемого в ветеринарной практике.

Известно, что АСД–2 представляет собой прозрачную летучую жидкость, от желтого до темно-красного цвета, с резким специфическим запахом, плотностью до 1,135г/см3. Препарат имеет щелочную реакцию и хорошо растворим в воде.

Требования к качеству препарата были обоснованы А. В. Николаевым [1], и З. И. Дерябиной [2], которыми было также установлено, что с химической точки зрения, препарат представляет сложную смесь неорганических азотистых веществ (до 15%) в виде солей аммония и органических веществ, среди которых были идентифицированы первичные и вторичные амины, карбоновые кислоты жирного ряда, их амиды и аммонийные соли, холиновые эфиры карбоновых кислот. Было также показано, что химический состав препарата зависит, главным образом, от качества исходного сырья – мясокостной муки, которая должна содержать не менее 50% протеина и 12-15 % липидов.

И в наше время, производители препарата продолжают ориентироваться на эти результаты, с момента получения которых прошло практически 50 лет.

В связи с этим нам представлялось целесообразным продолжение работ в этом направлении с учетом имеющихся современных методов исследований.

В серии сообщений мы намерены представить результаты комплексного исследования по решению вышеназванной проблематики.

Оценка возможности использования метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса для определения химического состава органических соединений препарата АСД–2

Рассмотрение существующих современных методов анализа органических соединений и их смесей показало, что в наибольшей мере нашим требованиям может удовлетворять метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Спектроскопия ЯМР представляет собой особый вид абсорбционной спектроскопии. Явление резонанса в спектре ЯМР наступает при поглощении электромагнитного излучения парамагнитными ядрами (в состав которых входит нечетное число нейтронов или протонов, например изотопы 1Н, 13C, 15N, 19F), находящимися в однородном магнитном поле.

Для измерения явления резонанса пробу исследуемого вещества в виде жидкости вносят в однородное магнитное поле напряженностью 104 Гс. Исследуемое вещество размешают в центр индукционной катушки, создающей высокочастотное (1-50 МГц) электромагнитное поле. Затем измеряют напряженность внешнего магнитного поля до тех пор, пока не наступит явление резонанса и образец не начнет поглощать энергию высокочастотного поля и ток, протекающий по катушке, возрастает. Изменение величины протекающего тока (резонансный сигнал) может быть измерено и зарегистрировано, т.е. получают спектр ЯМР.

Поскольку в реальных условиях ядро экранировано электронной оболочкой, соответствующий резонансный сигнал проявляется при более высоких значениях напряженности внешнего магнитного поля по сравнению с неэкранированным ядром. Этот эффект обозначается химическим сдвигом и измеряется в миллионных долях (мл).

Для определения химического сдвига протонов (протонный магнитный резонанс, ПMP) исследуемого вещества применяют внутренний стандарт, как правило, тетраметилсилан (ТМС), резонансная частота которого совершенно не зависит от концентрации и химического состава анализируемого вещества. Сигнал протонов ТМС, находящийся в очень сильном поле, принимается равным нулю, все другие сигналы, расположенные в более слабых полях, имеют положительные значения.

В настоящее время имеется обширнейшая информация по спектрам органических соединений, позволяющая достаточно однозначно интерпретировать полученные результаты спектрального анализа по методу ЯМР.

Исследования в целом включали в себя следующие этапы:

– получение эталонных образцов препарата в стеклянной установке из нормализованной сырья по методу Дорогова, в том числе и обезжиренного;

– получение стандартных образцов препарата из серийной мясокостной муки;

– определение физико-химических показателей препарата известными способами (плотность, щелочность и др.);

– проведение анализа методом спектроскопии ЯМР и сравнение результатов анализа для препаратов, полученных различными производителями.

1. Экспериментальная часть.

1.1. Подготовка образцов сырья.

Эталонные образцы препарата получали из мясокостной муки по ГОСТ 17536-82 1-ого сорта, содержащей не менее 55% протеина и влажностью 5-5,5%. Нормализация сырья производилась путем сушки серийной муки до остаточной влажности 0,5% (температура 110°С) с последующим добавлением необходимого расчетного количества дистиллированной воды.

Для факультативного исследования производили обезжиривание муки, путем экстракции жиров хлористым метиленом с последующей фильтрацией образцов и сушкой осадка до окончательного удалением остаточного растворителя.

При исследовании влияния качества серийно производимого сырья на показатели АСД–2 использовали муку с содержанием протеина в диапазоне от 30 до 60%, влажностью 3–10%.

1.2. Аппаратура и методика процессов термического разложения.

1.2.1. Опыты по получению эталонных образцов АСД–2 проводили в кубе Фаворского, представлявшем собой цельнопаянную из термостойкого стекла (пирекс) установку, состоявшую из колбы (500мл), дефлегматора, прямого холодильника, отводной трубки и аллонжа. К аллонжу с помощью шлифа подсоединяли сменный градуированный приемник (50 мл). В крупнодонную колбу и в дефлегматор устанавливаются термометры с диапазоном измерения температуры до 500°С. Нагрев производили на песчаной бане. Температуру регулировали с помощью лабораторного автотрансформатора (ЛАТР), термопары и пирометра. Разложение мясокостной муки производили со скоростью не более 50С в минуту в диапазоне 150–450°С, давая при температурах 250, 350 и 450°С выдержки не менее 1 часа.

1.2.2. Термическое разложение образцов серийной муки проводили на стендовой установке, состоявшей из муфельной печи с массой загрузки 50 кг, кожухотрубчатого теплообменника, приемной емкости, обогреваемого сепаратора-отстойника и системы фильтров, позволяющей произвести качественное разделение водной и масляной фракции. Вся установка была выполнена из нержавеющей стали.

Разложение мясокостной муки производили со скоростью не более 50°С в минуту в диапазоне 150-450°С, давая при температурах 250, 350 и 450°С выдержки не менее 3 часов.

В качестве образцов сравнения испытывали препарат АСД–2 производимый Армавирской (Россия) и Голещинской (Украина) биофабриками.

1.3. Спектроскопия ЯМР

Спектры ЯМР 1Н (ПМР) регистрировались на спектрометре GEMINI – 300 относительно эталона дейтерированного диметилсульфооксида ДМСО-d6 (CD3 – SO – CD3). Остаточный сигнал ДМСО проявляется в спектрах в области 2,49 м.д. относительно эталона тетраметилсилана ТМС ((CH3)4Si). В ампулу заливали 1мл образца и опускали в нее капилляр, заполненный внешним эталоном гексадейтерометилсульфооксидом ДМСО-d6. Спектр записывался после накопления большого количества (n ~ 500-3000) импульсов.

2. Обсуждение результатов

Свежеприготовленные эталонные образцы препарата, полученные как с нормализованной, а также с обезжиренной мясокостной муки с содержанием протеина 55% представляли собой прозрачную летучую жидкость плотностью до 1,13 г/см3 светлокоричневого цвета с красноватым оттенком, рН=9,5. В процессе фильтрации, по видимому за счет контакта с кислородом воздуха, препарат приобретал равномерный коричневый цвет, соответствующий цвету чайной заварки. В значительном ряде случаев в процессе отстоя препарата наблюдали выпадение осадка, после чего плотность раствора снижалась до 1,09-1,10 г/см3.

Практически этих же результатов удалось достигнуть и при получении препарата в условиях укрупнений стендовой установки при использовании серийной муки с содержанием протеина выше 50% и имевшей влажность не более 5%.

В таблице 1 представлены результаты определения показателей АСД–2, полученного из сырья различного качества.

На рис. 1 представлен характерный вид спектра ЯМР 1Н для эталонного образца АСД–2 фирмы “Ареал-Медикал”, полученного из нормализованного сырья с расшифровкой возможных классов соединений, составляющих органическую часть препарата. Как видно из рисунка, сигналы протонов различных функциональных групп выражены достаточно четко и позволяют идентифицировать их наличие или отсутствие в препарате. Следует отметить, что спектры, полученные для эталонных и стандартных образцов препаратов, а также продукции различных производителей в значительной мере совпадают.

В таблице 2 представлены данные, характеризующие ПМР – спектры образцов препарата АСД–2, полученного фирмой «Ареал-Медикал» (1 эталон, 2 стандарт), Армавирской (3 стандарт) и Голещинской (4 стандарт) биофабриками.

ТАБЛ. 2. ХАРАКТЕРИСТИКИ СПЕКТРОВ ПМР РАЗЛИЧНЫХ ОБРАЗЦОВ АСД

● n – количество исследованных образцов.

** – отсутствует

*** + присутствует

● Как видно из данных таблицы 2, в спектрах всех образцов препарата АСД–2 наблюдаются сигналы протонов алифатических органических соединений, содержащих следующие функциональные группы: R3 N+-, СНз(С=О)-, CH3-S-, CH3-NH(C-O)NH-, (СН2)n-(циклические соединения). Спектры ПМР отличала повторяемость и удовлетворительное воспроизводство. Наблюдаемое расширение областей допустимых значений химического сдвига функциональных групп для образцов препарата АСД–2 (2 стандарт), объясняется нами значительно большим объемом проанализированных образцов и влиянием неизбежных изменений химического состава различных образцов сырья и технологических режимов получения.

Вывод о том, что препарат АСД–2 изготовленный фирмой “Ареал-Медикал” не содержит ароматических веществ, подтверждается отсутствием в спектрах ПМР сигналов в области 7,2 м.д., характерных для протонов бензольного кольца и других ароматических веществ, в том числе и гетероциклических.

Однако в спектрах ЯМР отдельных образцов препарата АСД–2, изготовленного Армавирской и Голещинской биофабриками, наблюдали сигналы протонов ароматических веществ (сигналы в области ? > 5), что свидетельствует о наличии в данных образцах производных фенолов и (в образце 4 стандарт) замещенных изонетрилов, содержащих ароматические фрагменты. По нашему мнению этот факт свидетельствует о присутствии в образцах АСД–2 следов масляной фракции образцов АСД–3.

● Сравнение интегральной интенсивности сигналов протонов соответствующих функциональных групп по высоте пиков сигналов показало, что в образцах препарата АСД–2 фирмы “Ареал-Медикал” (1-эталон; 2-стандарт) наблюдается максимальная концентрация четвертичных аммониевых солей (в 3-4 раза превышающая соответственно показатель препарата АСД-2 Армавирской биофабрики), а также отмечено пониженная концентрация меркаптанов.

● В связи с тем, что ранее [2] высказывалось мнение о присутствии в препарате АСД–2Ф холиноподобных веществ, нами был получен ПМР – спектр данного вещества в аналогичных условиях анализа.

Он содержит следующие сигналы м,д.: 2,0265 с (3Н), 3,1038 с (9Н), 3,7627 т (2Н) и 4,41 г (2Н). Этих сигналов в спектре всех трех фракций не найдено. Рассмотрение результатов показывает, что сигнал с ? =3,1038 (9Н) соответствует протонам метальных групп при четвертичном азоте и практически совпадает с соответствующим резонансным сигналом в спектре АСД–2Ф, что в определенной мере объясняет, с химической точки зрения, вывод 3. И. Дерябиной о холиномиметических свойствах препарата АСД–2.

● Полученные результаты свидетельствуют в пользу применения спектра ПМР препарата АСД–2 для определения его подлинности в виду однозначности интеграции химического состава органической части препарата. Таким образом, данный спектр ПМР препарата АСД–2 можно применять не только для проверки его подлинности, но и для оценки качества разделения водной и масляной фракции.

Выводы

1. Впервые обоснована возможность применения метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса, а именно протонного 1Н (протонного магнитного резонанса, ПМР) для определения химического состава органических соединений препарата АСД–2 и подтверждения его подлинности и качества разделения водной и масляной фракции в процессе производства.

2. Установлено, что образцы препарата АСД–2Ф (фирмы Ареал-Медикал) в наибольшей мере соответствует прототипу; отличаются высокой плотностью, максимальной концентрацией четвертичных аммониевых органических кислот и пониженным содержанием меркаптанов.

4. Установлено, что в отдельных образцы препарата АСД–2, произведенного Арамвирской (РФ) и Голещинской (Украина) биофабриками, содержатся ароматические органические вещества (производные фeнолoв), что свидетельствует о наличии масляной фракии АСД–З.

Литература

1. Николаев А.В. О химическом составе и новых фракциях препарата АСД./Труды ВНИЭВ.-т.22, с. 317-326, 1958

2. Дерябина З.И. Химико-фармакологическая характеристика препарата АСД/ Труды ВНИЭВ, т.25, с. 326-339, 1963

3. Иоффе Б.В., Костиков Р.С., Разин B.В. Физические методы определения строения органических соединений – М. Высшая школа, 1984,

4. 0рганикум. Практикум по органической химии.- М.»Мир», 1979, т.1,2.