Метод ізотопних індикаторів у дослідженнях в галузі сільськогосподарської біології. Радіоавтографія. Особливості використання стабільних ізотопів

Міченими атомами називають ізотопи, котрі, відрізняючись по масі від

атому елемента, можуть використовуватись як мітка (індикатор) при вивченні найрізноманітніших процесів розподілу, переміщення і

перетворення речовин у складних системах, в тому числі і в живих

організмах.

Як мітку використовують не тільки радіоактивні, а й стабільні ізотопи. Сам метод ізотопних індикаторів базується на двох положеннях:

- хімічні властивості різних ізотопів одного елемента практично однакові, завдяки чому їх поведінка в процесах, які вивчаються, не

відрізняється від поведінки інших атомів того ж елементу;

- радіоактивні ізотопи у кількостях, що застосовуються у якості мітки, не чинять біологічної дії на живі організми.

Угорський хімік Д. Хевеші та німецький хімік Ф. Панет запропонували цей метод в 1913 р., вперше застосувавши його в біологічних експериментах.

Використання методу ізотопних індикаторів не обмежується

інтересами радіобіології і біології в цілому. Він використовується також у медицині і медичній промисловості, хімії і хімічній промисловості, геології, фізиці, металургії, матеріалознавстві, археології. Широкого застосування метод набув у сільському господарстві для оцінки фізичних властивостей ґрунту і запасів в ньому елементів живлення, для вивчення взаємодії ґрунту та добрив, процесів засвоєння рослинами елементів живлення з ґрунту і добрив, позакореневого надходження в рослини елементів, для виявлення дії на рослинний організм пестицидів, вивчення особливостей обміну речовин сільськогосподарських рослин.

В тваринництві за допомогою цього методу вивчають фізіологічні процеси, що протікають в організмі тварин, проводять аналіз корму на вміст токсичних речовин, малі кількості яких важко визначити за допомогою інших методів, використовують його для вивчення міграції комах-шкідників

сільськогосподарських рослин і переносників хвороб сільськогосподарських тварин, поведінки бджіл, оцінки рибних запасів місцевих водоймищ, а також в багатьох інших сферах сільськогосподарського виробництва.

Чутливість методу ізотопних індикаторів з використанням стабільних ізотопів значно нижча від чутливості методу з використанням радіоактивних

ізотопів. Якщо для першого межа точності оцінки вмісту ізотопу в зразках складає 10-4-10-6%, то за допомогою другого можна фіксувати випромінення ізотопу при кількості його в пробі в залежності від типу ізотопу 10-11-10-19%. Тому, при можливості вибору слід віддавати перевагу методу радіоактивних ізотопів.

В агрохімічних та фізіологічних дослідженнях найчастіше використовують такі ізотопи: стабільні - 2Н, 13С, 15N, 18О та радіоактивні - 3Н (β-, 12,26 року), 14С (β-, 5730 років), 22Na (γ-, 2,64 року), 32Р (β-, 14,3 доби), 35S (β-, 87 діб), 42К (β-, γ-, 12,5 год.), 45Са (β-, 152 доби), 59Fe (β-, γ-, 45,1 доби),

60Со (β-, γ-, 5,27 року), 65Zn (γ-, 250 діб), 86Rb (β-, γ-, 19,5 доби).

Стабільні ізотопи одержують шляхом послідовних складних операцій, які мають назву „ізотопного розділу”. Радіоактивні ізотопи одержують

шляхом опромінення нерадіоактивних речовин в атомних реакторах і прискорювачах заряджених частинок (по аналогії з 60Co для опромінюючих пристроїв), або шляхом хімічного виділення з суміші відходів ядерного палива (по аналогії з 137Cs ).

Мічені сполуки - це хімічні речовини, в яких атоми одного або декількох елементів, мають ізотопний склад, що відрізняється від природного. Їх одержують за допомогою трьох основних методів: хімічного синтезу, ізотопного обміну (іноді їх об’єднують під загальною назвою – хімічний шлях) та біологічного синтезу (біологічний шлях).

Хімічний синтез, як правило. здійснюється за допомогою звичайних методів препаративної хімії. Але на певному етапі синтезу до складу реакційних компонентів замість звичайного елементу включається потрібний ізотоп.

Ізотопний обмін - це хімічний процес, який полягає в перерозподілі

ізотопів якого-небудь елемента між реагуючими речовинами. При ізотопному обміні відбувається заміщення одного ізотопу елемента на інший в молекулі речовини без зміни їх елементарного складу. Наприклад: 39КСl +

42КOH = 39KOH + 42КCl

Мічені високомолекулярні сполуки біологічного походження, такі як нуклеїнові кислоти, білки, ферменти, деякі амінокислоти, гормони, вітаміни

та інші, хімічний синтез яких ускладнений або не можливий і котрі не завжди

вступають в реакції ізотопного обміну, отримують шляхом культивації різних організмів іn vivo або in vitro на середовищах, що містять ізотоп, або введення ізотопу в організм за допомогою яких-небудь інших методів, з наступним препаративним виділенням цих сполук.

Мічені сполуки і добрива.Метод ізотопних індикаторів дозволяє простежити долю конкретного елемента, що внесений з добривом або

утилізований в ґрунті до його внесення. Він дозволяє кількісно прослідкувати за надходженням, транспортом та засвоєнням певного елемента, оцінити швидкість йогo пересування по рослині, нагромадження в окремих органах з

точністю, яка на 5-10 порядків перевищує точність хімічних аналізів.

При проведенні агрохімічних досліджень або робіт в області фізіології мінерального живлення рослин з використанням методу ізотопних індикаторів необхідно мати мічені добрива. Основними вимогами до якості міченого добрива є такі: ізотоп-індикатор повинен перебувати у такій же хімічній формі, що і елемент живлення в складі добрива; він повинен бути рівномірно розподілений по всій масі добрива; кількість його повинна бути достатньою для визначення відповідними вимірювальними приладами; не викликати будь-яких суттєвих відхилень у перебігу біологічних процесів.

У якості індикаторів в добривах використовують і стабільні і радіоактивні ізотопи. Головною перевагою стабільних ізотопів є відсутність іонізуючих випромінень. Однак, мала їх доступність, порівняно складна

техніка виявлення і відносно низька чутливість складають головні недоліки методик з використанням стабільних ізотопів.

Радіоактивні ж ізотопи мають такі незаперечні переваги: можливість їх отримання практично для всіх елементів періодичної системи, надзвичайно висока чутливість і точність визначення, відносна доступність вимірювальних приладів. Саме тому більшість досліджень із застосуванням методу ізотопних індикаторів проводиться саме з радіоактивними ізотопами.

Існують радіоактивні ізотопи всіх без винятку елементів живлення. Однак з ізотопів-макроелементів вище означені переваги мають лише 32Р, 35S,

45Ca, а з ізотопів-мікроелементів - 59Fe, 60Co, 65Zn та деякі інші. Що стосується інших елементів, то невеликий період піврозпаду робить

практично неможливим їх використання в довготривалому експерименті по вивченню, наприклад, транспорту елемента, його включення в метаболізм з точним кількісним підрахунком. Так, період піврозпаду найбільш довгоживучого радіоактивного ізотопу азоту 13N складає лише 10 хвилин. Радіоактивний ізотоп калію 40К має великий період піврозпаду - більше мільярда років, але дуже низьку радіоактивність і не може використовуватись для точних оцінок. Його штучний аналог ізотоп 42К має достатню радіоактивність, але короткий період піврозпаду - 12,4 години. Короткий період піврозпаду у радіоактивного ізотопу міді - 64Cu – 12,8 години, молібдену 99Мо - 67 годин, деяких інших мікроелементів. Ці ізотопи звичайно використовують лише у спеціальних короткочасних експериментах, наприклад, для вивчення окремих етапів їх надходження в рослини, швидкості всмоктування через корені, локалізації в листі при позакореневому внесенні та подібних.

Для отримання мічених азотних добрив застосовують стабільний ізотоп азоту 15N. Для вивчення транспорту та утилізації калію взагалі немає придатного стабільного або радіоактивного ізотопу і замість нього використовують штучний радіоактивний ізотоп рубідію 86Rb з періодом піврозпаду 19,5 діб - елемента, який звичайно зустрічається в природі як ізоморфна домішка в калії і вважається його близьким хімічним аналогом.

Способи одержання мічених добрив.Існує два основних способи одержання мічених добрив. Перший передбачає введення мітки в добриво в

процесі йогo отримання по заводській технології, Наприклад, розчин, що містить радіоактивний фосфат кальцію Са3(32РО4)2, нерадіоактивна сіль якого складає основу природних фосфатів (фосфориту і апатиту) або апатитового концентрату, додають до сірчаної кислоти, якою вони обробляються при отриманні звичайного простого суперфосфату, або до фосфорної кислоти - при отриманні подвійного суперфосфату.

Аналогічним шляхом можуть бути одержані мічені азотні і калійні добрива, коли в процесі виготовлення в залежності від хімічної основи добрива до них додають мічені солі (15NН4)2SO4, 15NH4Cl, 15NH4NO3 або її різновиди за місцем мітки: NH415NO3, 15NH415NO3, 86RbCl, 86Rb2SО4.

Другий спосіб простіший і тому частіше використовується в

дослідницьких цілях. Він полягає в простому змішуванні розчину радіоактивної солі з водяною суспензією готового добрива в лабораторних умовах. Після цього суспензія висушується до вихідної вологості добрива. Цей спосіб є менш досконалим, але цілком придатним за умов, що досягається рівномірний розподіл мітки по всій масі добрива.

Ще простіше готуються мічені рідкі поживні розчини і середовища для водяних та піщаних культур. В цьому випадку, у відповідності до складу поживної суміші, частина солі, яка повинна нести конкретну мітку, замінюється препаратом, що містить ізотоп.

Важливим моментом при приготуванні добрив або поживного розчину, мічених радіоактивним ізотопом, є вибір індикаторної дози ізотопу. З одного

боку, вона повинна бути достатньо високою, щоб забезпечити точність в оцінці участі в метаболізмі рослини досліджуваного елемента. Але з другого,

- не настільки високою, щоб спричинити радіаційну дію. При цьому слід враховувати, що не тільки інгібуюча дія ізотопу, але й стимулююча може

викривити картину надходження і перетворення елемента.

Основні шляхи використання радіоактивних ізотопних індикаторів в дослідженнях з рослинами.За допомогою методу ізотопних індикаторів у біології рослин, зокрема фізіології, та агрохімії найчастіше вирішуються два основні завдання: дослідження транспорту і розподілу в рослині окремих елементів та вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі.

Введений в рослину мічений елемент включається в метаболізм, в процесі якого з ним можуть відбуватися різні хімічні перетворення, внаслідок яких речовини "перемічуються", тобто мітка - ізотоп може потрапляти до складу інших сполук. Для ідентифікації того, в якій хімічній формі і до складу якої сполуки включився мічений елемент поєднують метод ізотопних індикаторів з іншими фізіологічними, біохімічними, цитохімічними методами та засобами препаративного розділу і аналізу суміші речовин.

Дослідження транспорту та розподілу в рослинах окремих елементів. Частіше вводять мічений елемент в складі якої-небудь сполуки через кореневу систему. Якщо рослина вирощується в умовах ґрунтової або

піщаної культури, то це проводять шляхом поверхневого поливу субстрату

розчином, який містить мічену речовину, і підгрунтовим його введенням через дренажну трубку.

Позакореневе введення ізотопу проводиться двома шляхами:

обприскуванням з пульверизатора або змочуванням поверхні листя.

Для отримання змістовної картини розподілу міченого елементу по рослині використовують метод радіоавтографії.

Вивчення ролі окремих речовин в метаболізмі рослин.За допомогою

методу радіоактивних ізотопів були отримані відомості про особливості фосфорного, кальцієвого, сірчаного обміну в рослині, про фізіологічну роль багатьох мікроелементів, фундаментальні дині про перетворення окремих речовин.

Застосування методу мічених атомів дозволило більш глибоко вирішити питання про роль вуглецю у фотосинтезі. Тільки з можливістю одержання міченого вуглекислого газу 14СО2 вдалося відслідкувати його перетворення у складні органічні сполуки. Цей шлях біосинтезу відомий під назвою циклу Кальвіна, або відновлювального пентозофосфатного циклу.

В тому випадку, коли отримують тонкошарові хроматограми або електрофореграми з них можна зняти радіоавтографи, які відображають картину розподілу радіоактивного міченого елемента у складі різних сполук. Радіометричний їх аналіз дозволяє кількісно оцінити динаміку розподілу вуглецю. Такі підходи і дозволили вивчити шляхи фіксації і перетворення вуглецю при фотосинтезі.

Особливості застосування радіоактивних ізотопів у вегетаційних та польових дослідженнях.Для вивчення надходження та транспорту окремих елементів в рослину використовують звичайну техніку постановки вегетаційних дослідів. При цьому слід дотримуватись запобіжних заходів проти поширення радіоактивного забруднення.

Особливості поглинання елементів живлення рослинам з добрив за допомогою методу ізотопних індикаторів можуть бути добре вивчені в польових умовах. В цьому випадку важливим завданням є внесення в грунт мічених добрив. В дослідах з однорічними рослинами мічене добриво, як і звичайне, може вноситись перед посівом при ретельному перемішуванні його з ґрунтом. В експериментах з багаторічними рослинами або внесенні мічених добрив під вегетуючу однорічну рослину, наприклад, в період формування продуктивних органів, використовують два способи внесення - поверхневий та глибинний.

Досліди в польових умовах бажано проводити з коротко- та середньоживучими ізотопами, наприклад, застосовувати 89Sr замість 90Sr,

134Сs замість 137Сs.

Радіоавтографія.Надзвичайно важливою перевагою радіоактивних ізотопів є їх властивість залишати слід на фотоматеріалах. Ця їх здатність широко використовується для вивчення локалізації мічених сполук в окремих органах за допомогою методу радіоавтографії.

Радіоавтографія, або авторадіографія, - це спосіб вивчення розподілу радіоактивних речовин в досліджуваному об'єкті шляхом накладання на нього чутливих до іонізуючих випромінень фотоматеріалів. Саме за допомогою радіоавтографії А. Беккерель відкрив явище радіоактивності.

Метод радіоавтографії базується на фотографічному методі виявлення іонізуючих випромінень, який полягає в тому, що іонізуюче випромінення, проходячи через фотоемульсію, викликає відновлення іонів срібла до

нейтральних атомів. Після проявлення і фіксації на шарі фотоемульсії з'являються центри потемніння. Розміри і ступінь потемніння ділянок залежить від кількості частинок або квантів, що потрапили на них. При цьому на фотоматеріалах утворюється негативне зображення. На отриманому

з нього позитивному відбитку (радіоавтографі) світлі місця відповідають найбільшій інтенсивності випромінення, менш світлі - меншій інтенсивності,

а темні - його відсутності. Таким чином, за ступенем засвічування фотоматеріалів можна судити про інтенсивність випромінення і, відповідно, про кількість радіоактивної речовини, що міститься в будь-якій ділянці досліджуваного об’єкту.

Радіоавтограф, або авторадіограма, - це фотографічне зображення розподілу радіоактивних речовин в досліджуваному об'єкті, яке одержане за допомогою методу радіоавтографії.

До головних переваг методу радіоавтографії слід віднести такі:

можливість одержання просторової картини розподілу радіоактивної речовини в досліджуваному зразку; високу чутливість методу, що дає можливість виявити в зразку такі малі кількості радіоактивних речовин, які не можуть бути виявлені за допомогою лічильників радіоактивності; можливість кількісної оцінки нагромадження речовини в різних ділянках досліджуваного об'єкту; можливість оцінки радіоактивності і її кількісного визначення в дуже малих кількостях; одержання об'єктивного документа, що фіксує всі результати досліду - радіоавтографа.

Виділяють дві основні різновидності радіоавтографії -

макрорадіоавтографію і мікрорадіоавтографію. В основі обох лежить принцип контактної радіоавтографії, при якому об’єкт дослідження

безпосередньо контактує з фотоматеріалом.

Макрорадіоавтографія має справу з великими об’єктами - цілими рослинами, окремими органами - листками, квітками, зрізами плодів та іншими. При цьому фотоплівка або фотопластинка прикладається до рівної поверхні зразка і притискується пресом. Після експонування і проявлення радіоавтограф аналізується в прохідному світлі шляхом порівняння ступеня почорніння фотоматеріалу.

Об’єктами мікрорадіоавтографії є мікроскопічні препарати - зрізи, давлені препарати, мазки та інші. При цьому розплавлена рідка фотоемульсія безпосередньо наноситься на зразок, утворюючи при застиганні щільно

прилягаючий до зразка шар. Після експонування та проявлення радіоавтограф разом з об'єктом досліджується під оптичним або електронним

мікроскопом у відбитому, а у випадку прозорості об'єкту і в прохідному світлі. Аналіз полягає у підрахунку слідів, що утворилися іонізуючими частинками у фотоемульсії на фоні різних тканинних та клітинних структур.

Для одержання макрорадіоавтографів використовують фотоматеріали з великими мікрокристалами - зернами розміром 0,2-0,5 мкм (звичайні aбo рентгенівські фотопластинки чи фотоплівки), а для отримання мікрорадіоавтографів застосовують особливі дрібнозернисті ядерні

фотоемульсії з зернами розміром 0,01-0,02 мкм.

Для одержання радіоавтографів в рослину вводять речовину, яка містить радіоактивний ізотоп. Для отримання макрорадіоавтографів зрізують окремі листки або інші органи чи беруть все рослину цілком, кладуть на

фільтрувальний папір, розправляють як для гербарію і зверху також накривають фільтрувальним папером. Підготовлений таким чином об'єкт

розміщують між двома рівними металевими пластинками і під пресом кладуть в сушильну шафу при температурі 80-850C. Після повного висушування в фотографічній кімнаті на нього накладають фотопластинку, накривають м'якою тканиною і знову під пресом кладуть в світлонепроникну камеру або спеціальну касету.

Час експонування оцінюється експериментально і складає доби-тижні, але може тривати і місяці. Після проявлення фотопластинки одержують

макрорадіоавтограф, що характеризує розподіл інкорпорованого радіоактивного ізотопу в рослині.

Нерідко виникає потреба одержати макрорадіоавтограф зі свіжої ще вологої рослини (наприклад, при роботі з короткоживучими ізотопами). В цьому випадку зразок обкладають водонепроникною прокладкою із полімерної плівки й розміщують на поверхні фотоматеріалу або загортають

нею фотоплівку.

Для мікрорадіоавтографії звичайно використовують фіксовані препарати окремих органів або тканин рослини, в яку введений paдіоактивний ізотоп. На висушені препарати наносять фотоемульсію, експонують, проявляють і одержують мікрорадіоавтографи, на яких під мікроскопом можна виявити потемніння певних ділянок у вигляді окремих точок, розмір яких визначається розміром зерен срібла, утворених ними

скупчень.

Метод радіоавтографії дозволяє не тільки виявляти локалізацію міченої сполуки в рослині, тканині або клітині, але й оцінити її кількість, оскільки кількість зерен відновленого срібла емульсії прямо пропорційна інтенсивності діючого на нього випромінення. Кількісний аналіз макрорадіоавтографів проводять за допомогою звичайних методів

фотометрії, а мікрорадіоавтографів - підрахунком під мікроскопом зерен, що приходяться на одиницю площі або окрему структуру, наприклад, ядро, хромосому.

Особливості використання стабільних ізотопів.У зв'язку зі значно нижчою чутливістю методу можливості застосування в ролі мітки стабільних

ізотопів в агробіологічних та інших дослідженнях обмежені у порівнянні з радіоактивними ізотопами. Проте, стабільні ізотопи як індикатори можна застосовувати для вирішення майже всіх завдань, в яких використовуються радіоактивні ізотопи, хоча з меншим успіхом і точністю.

Початкові стадії методик із застосуванням стабільних ізотопів не відрізняються від тих, де використовуються радіоактивні ізотопи. Специфіка методу проявляється лише на заключних етапах кількісного аналізу проб.

Цей аналіз проводять на мас-спектрометрах - приладах, які призначені для розділення речовини за масами атомів і молекул. Принцип роботи мас- спектрометра оснований на дії магнітних і електричних полів на іонізовані пучки частинок у вакуумі з наступним їх сортуванням за атомними масами.

Із стабільних ізотопів найбільш широко використовуваним є ізотоп азоту 15N. Роботи з ним ведуться за такими основними напрямками: вивчення швидкості поглинання рослинами вільного азоту та азоту, що входить до складу різних азотистих сполук, в тому числі і добрив; визначення здатності до фіксації атмосферного азоту у різних видів рослин та вивчення швидкості процесів обміну азотистих сполук в рослинах.

Мас-спектрометричному аналізу піддають суміш ізотопів у газоподібному стані. Для цього досліджуваний матеріал спалюють за методом Кьєльдаля, а одержаний із сірчанокислого амонію аміак окислюють у вакуумі гіпобромітом до вільного азоту. Найменший надлишок атомного проценту, який можна виявити в пробі, складає 0,01-0,02, що відповідає приблизно 0,1-0,2 мкг 15N в 1 мл азоту за нормальних умов. Це досить висока точність.