Поиск и отбор наиболее перспективных БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ субстанций

Имеется 10¹⁸⁰ возможных биологически активных ве-

ществ, 10¹⁸ вероятных лекарственных препаратов, 107 из-

вестных соединений, 106 коммерчески доступных соедине-

ний, 10⁶ соединений в базах данных фирм, 104 соединений

в базах данных по лекарствам, 10³ коммерческих лекарств

и 10² коммерчески выгодных лекарств.

Weininger

Как уже было сказано ранее, пусковым, базисным этапом в создании любого нового лекарственного средства является нахождение «соединения –лидера» - наиболее перспективного соединения, на основе которого (после оптимизации) потом создадут лекарственный препарат. Легко сказать…….., но где же это перспективное вещество взять? На какой полке оно лежит?

Из истории медицины известно, что научные основы целенаправленного поиска биологически активных веществ или фармакологического скрининга сформировались сравнительно недавно – только в начале XX века. Именно тогда в 1910 году появилось знаменитое лекарственное средство 606 или сальварсан для лечения сифилиса - Пауль Эрлих провел целенаправленный поиск противосифилитических средств среди более чем, 10 тысяч органических соединений мышьяка и остановился на веществе под номером 606. С тех пор эта цифра стала нарицательной для фармакологов занимающихся поиском и разработкой лекарственных средств.

В настоящее время получение новой активной субстанции (действующего вещества или комплекса веществ) идет по трем основным направлениям:
• Химический синтез лекарственных веществ

• Эмпирический путь: скрининг, случайные находки;

• Направленный синтез: воспроизведение структуры эндогенных веществ, химическая модификация известных молекул;

Фармакологический скри́нинг (от англ. screen просеивать, сортировать, отбирать) - отбор новых продуктов химического или биологического синтеза, перспективных для применения в качестве лекарственных средств. Смысл скрининга в фармакологии заключается в выявлении различными методами фактической фармакологической активности (или потенциальной активности) у вновь синтезированных или природных соединений. Конечная цель скрининга – выявление соединений-лидеров. Соединение-лидер - это химическое соединение, которое проявляет в эксперименте перспективный, но не всегда оптимальный уровень искомой фармакологической активности. Часто это только структурный прототип будущего лекарства. Однако в случае очень большого везения исследователь может натолкнуться на искомое вещество и сразу.

Существует несколько методологий поиска биологически активных соединений, которые основаны на различных подходах.

Эмпирический или экспериментальный скрининг in vivo– непосредственно на лабораторных животных по тем или иным тестам исследуются относительно небольшие выборки соединений на наличие определенной фармакологической активности. При этом перспективные молекулы находили (и находят) либо случайно или путём перебора. Весьма трудоемкий и дорогостоящий процесс. Вряд ли его можно считать полностью научным, однако с его помощью долгое время находили (и сейчас находят) и активные новые молекулы и удачные лекарства, составляющие значительную часть фармакологического арсенала. Кроме того, необходимо отметить, что использование данного подхода в ряде случаев является весьма оправданным и целесообразным, так как далеко не всегда известен молекулярный механизм фармакологического эффекта. Например, в тех случаях, когда поиск проводится среди объектов природного происхождения (растительных экстрактов, извлечений из тканей животных и т.д.). В этих случаях исследователь оказывается в ситуации, когда действующее вещество пока неизвестно или желаемый эффект оказывает сумма веществ – значит воздействие in vitro нельзя смоделировать и эффект можно «поймать» только на живой модели. В ряде случаев искомый фармакологический эффект является отражением комплексного воздействия вещества на различные звенья патогенетического процесса – например гепатозащитное, ранозаживляющее, антигипоксическое, противовоспалительное действие и т.д. В данной ситуации основным методом поиска может быть только скрининг in vivo. Однако трудоемкость и низкая продуктивность при реализации такого подхода не позволяет подвергать быстрому первичному исследованию очень большие массивы соединений (которые еще и необходимо постоянно синтезировать). Что же дальше? На сегодняшний день по оценке академика РАН Н. С. Зефирова уже синтезировано около 20 млн. Из всего этого многообразия до уровня лекарственных препаратов дошло только несколько тысяч веществ.

Высокопроизводительный скрининг in vitro и drug-designВ настоящее время методология поиска перспективных лекарственных соединений компаниями-разработчиками и контрактными исследовательскими организациями (CRO) в корне изменилась. В основе современной методологии поиска биологически активных веществ лежит направленное конструирование новых лекарственных веществ - drug-design, который сочетает в себе возможности высокопроизводительного скрининга на основе HTS-технологий, методы комбинаторной химии и наличие «библиотек» содержащих миллионы соединений (Рис. 2 -5).

HTS high throughput screening -роботизированное определение биологической активности множества разнообразных соединений и выявление среди них соединений-лидеров с наилучшими характеристиками в больших сериях однотипных молекул (например., в библиотеках белков, кДНК или генов).

Все начинается с поиска соединения лидера. Где и как найти соединение-лидер? Какую стратегию поиска лидеров использовать? В данной ситуации возможны различные варианты.

Ключевыми понятиями драг-дизайна являются «мишень» и «лекарство». Очевидно, что если ищешь что-то не зная что именно, то нужно по крайней мере знать для чего оно нужно. Иными словами – для того чтобы найти соединение-лидер, нужно знать его потенциальную мишень – ту макромолекулу в организме человека к которой оно будет иметь максимальный аффинитет и воздействуя на него будет вызывать желаемый эффект. Пожалуй, это идеальная ситуация, когда известна мишень - макромолекулярная биологическая структура, предположительно связанная с определенной функцией, нарушение которой приводит к заболеванию и на которую необходимо совершить определенное воздействие. Наиболее часто встречающиеся мишени — это рецепторы, ферменты, молекула ДНК или другие биомакромолекулы. Лекарство - это химическое вещество (как правило, низкомолекулярное), которое способно специфически взаимодействовать с мишенью и тем или иным образом изменять клеточный ответ, создаваемый мишенью. Если в качестве мишени выступает рецептор, то молекула лекарство будет, скорее всего, его высокоспецифичным лигандом, то есть соединением, специфическим образом взаимодействующим с активным сайтом рецептора.

По типу модификации клеточного ответа лиганды делят на три группы:

1. Агонисты увеличивают клеточный ответ;

2. Нейтральные агонисты связываются с рецептором, но не изменяют клеточный ответ по сравнению с базальным уровнем;

3. Обратные агонисты, или антагонисты понижают клеточный ответ.

Степень взаимодействия лиганда с мишенью измеряют аффинностью, или сродством. Аффинность равна концентрации лиганда, при которой половина мишеней связана с лигандом. Биологической же характеристикой лиганда является его активность, то есть та концентрация лиганда, при которой клеточный ответ равен половине максимального.

Если мишенью является фермент, то лекарство будет его высокоспецифичным субстратом (конечно же скорее ингибитором), который будет связывать с активным центром фермента и изменять ферментативную активность.

На данном этапе драг-дизайна самое важно выбрать правильную мишень, воздействуя на которую можно направленно регулировать одни биохимические процессы, не затрагивая (насколько это возможно) другие. Такое далеко не всегда возможно - не все заболевания являются следствием дисфункции только одного белка или гена.

Современные постгеномные технологии позволяют выявлять конкретные биологические функции мишеней связанные применительно проявлениям исследуемой болезни. Для этого используют методы экспериментальной валидации мишеней основанные либо на инактивации мишенией либо на подавлении их синтеза с последующим отслеживанием тех фенотипических проявлений, к которым приводит дисфункция мишеней. Высшим уровнем валидации является, несомненно, демонстрация того, что модификация мишени (например, блокирование или нокаут рецептора или ингибирование фермента) приводит к клинически идентифицируемым и воспроизводимым симптомам у человека, однако, понятно, такое можно наблюдать достаточно редко.

Теперь, когда мишень уже известна, начинаются непосредственные исследования больших массивов химических соединений на степень сродства к мишени. Исследование всех возможных с химической точки зрения лигандов («химическое пространство») невозможно даже теоретически – их не менее 10⁴⁰ различных лигандов. Поэтому на возможную структуру лигандов накладывается ряд ограничений, который существенно сужает химическое пространство. В частности, для сужения химического пространства накладываются условия подобия лекарству (drug-likeness) - правило пяти Липинского, согласно которому соединение, чтобы «быть похожим» на лекарство, должно:

• Иметь менее пяти атомов-доноров водородной связи (иначе будет бысто окисляться и выводиться);
• Обладать молекулярным весом менее 500 (через барьеры не пройдет);
• Иметь липофильность (log P — коэффициент распределения вещества на границе раздела вода-октанол) менее 5 (будет интенсивно депонировать в жировой ткани);
• Иметь суммарно не более 10 атомов азота и кислорода (это акцепторы водородной связи).

В качестве стартового набора лигандов часто используют так называемые библиотеки соединений, производимые специализирующимися на этом компаниями, либо содержащиеся в арсенале фармацевтической компании-разработчика. Такие библиотеки содержат тысячи и миллионы соединений. Этого, конечно, совершенно недостаточно для тестирования всех возможных вариантов, но этого, как правило, и не требуется. Задачей на этом этапе исследования является выявление соединений, способных после дальнейшей модификации, оптимизации и тестирования дать «кандидат» - соединение, предназначенное для тестирования на животных (доклинические исследования) и на людях (клинические исследования). Этот этап осуществляется с помощью высокопроизводительного роботизированного скрининга (in vitro) или его компьютерного (in silico) анализа - высокопроизводительного докинга.

Высокопроизводительный роботизированный скрининг – это оптимизированная конвейеризованная процедура, в результате которой большое количество химических соединений (> 10000) проверяется на аффинность или активность по отношению к специальной тестовой (имитирующей биологическую) системе(Рис. 2). По производительности различают разные виды скрининга:

• Низкопроизводительный (10000 ÷ 50000 образцов);
• Среднепроизводительный (50000 ÷ 100000 образцов) и
• Высокопроизводительный (100000 ÷ 5000000+ образцов).

Для скрининга как для «промышленной» процедуры очень важна эффективность, стоимость и время, потраченное на операцию. Как правило, скрининг производится на роботизированных установках, способных работать в круглосуточном и круглогодичном режиме.

Принцип скрининга достаточно прост: в плашки, содержащие тестовую систему (например, иммобилизованная мишень или специальным образом модифицированные целые клетки), робот раскапывает из пипетки исследуемые вещества (или смесь веществ), следуя заданной программе. Причем на одной плашке могут находиться тысячи «лунок» с тестовой системой, и объем такой лунки может быть очень мал, так же как и объем вносимой пробы (микро- или даже нанолитры). Потом происходит считывание данных с плашки, говорящее о том, в какой лунке обнаружена биологическая активность, а в какой — нет. В зависимости от используемой технологии детектор может считывать радиоактивный сигнал, флюоресценцию (если система построена с использованием флуоресцентных белков), биолюминесценцию (если используется люциферин-люциферазная система или ее аналоги), поляризацию излучения и многие другие параметры. Обычно в результате скрининга количество тестируемых соединений сокращается на 3-4 порядка. Соединения, для которых в процессе скрининга выявлена активность выше заданного значения, называются прототипами. Однако следует понимать, что такие «удачи» еще очень и очень далеки от конечного лекарства. Лишь те из них, которые сохраняют свою активность в модельных системах и удовлетворяют целому ряду критериев, дают предшественников лекарств, которые используются для дальнейших исследований.

Необходимо отметить, что даже библиотеки, содержащие более миллиона соединений, не в состоянии представить все возможное химическое пространство лигандов. Поэтому при проведении скрининга можно выбрать две различные стратегии: диверсификационный скрининг и сфокусированный скрининг. Различие между ними заключается в составе используемых библиотек соединений: в диверсификационном варианте используют как можно более непохожие друг на друга лиганды с целью охватить как можно большую область химического пространства, при сфокусированном же, наоборот, используют библиотеки родственных соединений, полученных методами комбинаторной химии, что позволяет, зная приблизительную структуру лиганда, выбрать более оптимальный его вариант. Здравый смысл подсказывает, что в масштабном проекте по созданию нового лекарственного препарата следует использовать оба этих подхода последовательно — сначала диверсификационный, с целью определения максимально различных классов удачных соединений, а потом — сфокусированный, с целью оптимизации структуры этих соединений и получения рабочих прототипов.

Если для мишени известно так называемое биологическое пространство, то есть какие-либо характеристики лигандов (размер, гидрофобность и т.д.), которые могут с ней связываться, то при составлении библиотеки тестируемых соединений выбирают лиганды, попадающие в «пересечение» биологического и химического пространств, так как это заведомо повышает эффективность процедуры.

Структуры прототипов, полученные в результате скрининга, далее подвергаются разнообразным оптимизациям, проводимым в современных исследованиях, как правило, в тесном сотрудничестве между различными группами исследователей: молекулярными биологами, фармакологами, моделистами и медицинскими химиками. С каждым шагом такого скрининга прототип приближается к предшественнику и затем к кандидату, который уже тестируется непосредственно на животных (доклинические испытания) и на людях — в процессе клинических испытаний. Таким образом, роль роботизированного скрининга состоит в значительном сокращении (на несколько порядков) выборки прототипов(Рис. 3 -5). .

Часто исследователям ничего не известно - ни структура биомишени, ни структура лиганда, то для поиска соединения-лидера используют метод комбинаторной химии (синтез библиотек соединений и их тестирование). Фактически, это то же самый перебор, только с использованием высокопроизводительного скрининга..

Если структура мишени известна, а структуру её лиганда не известна, учёные используются подход называемый de novo дизайн. Создается витуальная пространственную модель молекулы-мишени (3 D-модель), в том числе той её полости, с которой должно связываться лекарство. Далее производят виртуальное совмещение этой полости с различными молекулами — кандидатами на роль лидера – так называемый „докинг“ (от англ. docking – стыковка). Ситуация замечательна тем, что вещества для такогой процедуры не обязательно синтезировать – их структуры можно моделировать!!! В результате можно подобрать структуру определённого размера и геометрии, которая хорошо подходит под мишень. Смоделированное соединение синтезируют, испытывают на активность и, если таковая обнаружится, берут его в качестве соединения-лидера.

Очевидно, что самая оптимальная и упрощенная ситуация, если в нашем распоряжении есть структуры и биомишени, и воздействующего на неё лиганда. Исследователь заранее знает, для какого класса веществ ему нужно делать докинг, и фактически модифицирует в полости мишени структуру лиганда. Такой способ называется структурно-обоснованным дизайном.

Когда соединение-лидер найдено, начинается второй этап конструирования лекарства - оптимизация. Структура соединения-лидера модифицируется: для повышения активности, улучшения растворимости, селективности и т.д. Нужно так изменить соединение-лидер, чтобы оно имело нужную активность, селективность, растворялось в том, в чём удобно, не было токсичным. Естественно, для этого надо менять его структуру. На практике химики синтезируют структурные аналоги соединения-лидера и тестируют их на определённую физиологическую активность. Основная проблема на этой стадии заключается в том, что теоретически количество возможных аналогов огромно. Это значит, что и здесь необходимо применять рациональный подход, позволяющий предсказывать, какие именно аналоги нужно синтезировать. Для этого можно использовать опять же компьютерное моделирование, то есть докинг небольшого количества аналогов соединения-лидера с известной активностью. С его помощью удаётся понять, как расположены друг относительно друга химические группы, важные для связывания с мишенью, а значит, сократить количество синтезируемых аналогов.

В том случае, когда докинг невозможен, потому что неизвестна структура мишени, а есть только информация, что у каких-то веществ есть нужная активность, обычно используют метод QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Это направление возникло на стыке органической химии, математического моделирования и компьютерной химии. QSAR позволяет установить количественную связь между структурой вещества и его свойствами и выразить её в виде математической модели. Для этого в QSAR используются так называемые дескрипторы химической структуры. Дескриптор — это число (или математический параметр), которое характеризует структуру и параметры органического соединения: молекулярный вес, число определённых атомов, связей или групп, молекулярный объём, частичные заряды на атомах, число атомов углерода, число определенных функциональных групп? Для предсказания физиологической активности в QSAR обычно используют следующие дескрипторы: электронные эффекты (влияют на ионизацию или полярность соединения), стерические особенности структуры (играют важную роль при оценке прочности связывания исследуемого соединения с биомишенью), липофильность (способность растворяться в жирах характеризует способность лекарства преодолевать клеточные мембраны). Большую роль в QSAR имеют так называемые топологические дескрипторы.В этом методе структурная формула — чисто математическое понятие, граф. Из теории графов можно посчитать так называемые инварианты графов, которые и рассматриваются как дескрипторы. Применяются и сложные фрагментные дескрипторы, которые оценивают вклад различных частей молекулы в общее свойство. Они значительно облегчают исследователям обратное структурное конструирование неизвестных соединений с потенциально высокой активностью. Модель QSAR — это математическое уравнение, с помощью которого можно описать физиологическую активность (и вообще любое свойство).

Метод QSAR работает следующим образом. Сначала группу соединений с известной структурой и известными значениями физиологической активности (полученными из эксперимента) делят на две части: обучающий и тестовый набор. В этих наборах цифры, характеризующие активность, уже соотнесены с конкретной структурой. Далее выбираются дескрипторы — хорошие компьютерные программы способны перебирать многие сотни дескрипторов. На следующем этапе строят математическую зависимость активности от выбранных дескрипторов для соединений из тренировочного набора и получают так называемое QSAR-уравнение.

Правильность полученного QSAR-уравнения проверяют на тестовом наборе структур. Сначала вычисляют дескрипторы для каждой из тест-структур, подставляют их в QSAR-уравнение, рассчитывают значения активности и сравнивают их с уже известными экспериментальными значениями (рис. 3). Если для тестового набора наблюдается хорошее совпадение расчётных и экспериментальных значений, то данное QSAR-уравнение можно применить для предсказания свойств новых, ещё не синтезированных структур. По мнению академика РАН Н. С. Зефирова С помощью этого метода, имея в арсенале совсем небольшое количество химических соединений с известной активностью, можно предсказать необходимую структуру и тем самым резко ограничить круг поисков.

Рис. 2 Аппаратура, используемая для высокопроизводительного скрининга.

А. Роботизированная пипетка, в автоматическом высокопроизводительном режиме наносящая образцы тестируемых соединений в плашку с системой для скрининга. Типичное количество углублений на плашке — тысячи. Объем системы в одной лунке — микролитры. Объем вносимого образца — нанолитры. Б. Установка для высокопроизводительного скрининга и считывания флуоресцентного сигнала Mark II Scarina. Работает с плашками, содержащими 2048 углублений (NanoCarrier). Полностью автоматическая (работает в круглосуточном режиме). Производительность — более 100000 лунок (образцов) в день.

Рис. 3 Роль высокопроизводительного скрининга в разработке нового лекарственного препарата. Скрининг, будь то его лабораторный (in vitro) или компьютерный (in silico) вариант, — главная и наиболее ресурсоемкая процедура по выбору стартовых структур лекарств (прототипов) из библиотек доступных соединений. Выходные данные скрининга часто являются отправной точкой для дальнейшего процесса разработки лекарства (А. Чугунов, 2008).

Рис. 4 Пример молекулярного моделирования, основывающегося на структуре лиганда. Для циклического пептида уротензина II (внизу слева) определена трехмерная структура методом ЯМР спектроскопии водного раствора (вверху слева). Пространственное взаиморасположение аминокислотных остатков мотива ТРП-ЛИЗ-ТИР, являющегося важным для биологической функции, было использовано для построения модели фармакофора (вверху справа). В результате виртуального скрининга найдено новое соединение, демонстрирующее биологическую активность (внизу справа) (А. Чугунов, 2008; S. Flohr, M. Kurz, E. Kostenis, A. Brkovich, A. Fournier, T. Klabunde ,2002)

Рис. 5 Два варианта совместного использования высокопроизводительного скрининга и молекулярного моделирования. Сверху: последовательный итеративный скрининг. На каждом шаге процедуры используется сравнительно небольшой набор лигандов; по результатам скрининга строится модель, объясняющая связь между структурой и активностью. Модель используется для выбора следующего набора лигандов для тестирования. Снизу: «разовый» скрининг. На каждом шаге модель строится по обучающей выборке и используется для предсказаний на тестовой выборке (T. Lengauer, C. Lemmen, M. Rarey, M. Zimmermann, 2004).