Определение содержания сырого протеина в биомассе

Сжигание образца.На аналитических весах с точностью 0,0002г взвешивают 0,5г биомассы и помещают в длинногорлую колбу из тугоплавкого стекла (колба Квельдаля) ёмкостью 250 мл, туда же приливают 10мл концентрированной серной кислоты, добавляют катализатор - сульфат меди (несколько крупинок) и 2г сульфата калия для повышения температуры кипения смеси, что также ускоряет сжигание. Содержимое колбы осторожно перемешивают и в её горло вставляют стеклянный баллончик, неплотно закрывающий колбу. Устанавливают колбу в вытяжном шкафу в наклонном положении и нагревают на слабом огне. После того как жидкость перестанет пениться, выделение белых паров диоксида серы станет более равномерным, нагревание усиливают, чтобы кислота кипела непрерывно. Длинное горло колбы служит воздушным холодильником. При кипячении должны улетучиваться только продукты сжигания. Нагрев ведут до тех пор, пока жидкость в колбе не станет прозрачной. Если на стенках колбы осели обугленные частицы, то их смывают содержимым колбы, осторожно наклоняя и поворачивая её. Затем осветлённую жидкость дополнительно нагревают 1 -2 часа.

Отгонка аммиака.После окончания сжигания и неполного охлаждения колбы Квельдаля содержимое колбы разбавляют дистиллированной водой. Воду в количестве 10мл следует приливать из пипетки, осторожно спуская по стенке колбы. Затем содержимое колбы количественно переносят в мерную колбу на 100мл. Колбу Квельдаля 2-3 раза промывают порциями по 5-7мл дистиллированной воды, перенося смывы в мерную колбу. Для частичной нейтрализации раствора туда же добавляют 7-8мл 40% раствора щёлочи и содержимое колбы доводят до метки. После перемешивания отбирают пипеткой 20мл раствора и переносят его в прибор для отгонки аммиака по микрометоду.

Воронку прибора ополаскивают 3-5мл дистиллированной воды и вместе с водой вводят 1-2 капли смешанного индикатора. Добавляют 40% раствор щёлочи до перехода красно-фиолетового окрашивания в зелёное. В коническую колбу, служащую приёмником, из бюретки наливают 5мл 0,1н серной кислоты и добавляют до 10мл дистиллированной воды. Колбу подставляют под холодильник прибора так, чтобы конец трубки находился в кислоте. После этого прибор соединяют с парообразователем и начинают отгонку.

Жидкость в сосуде быстро нагревается и начинает кипеть. Отгонка аммиака заканчивается через 15мин. В течение последних 5 минут приёмную колбу с титрованной серной кислотой опускают так, чтобы конец трубки холодильника не касался раствора.

В приёмную колбу добавляют 2-3 капли смешанного индикатора, и избыток кислоты оттитровывают 0,1н раствором щёлочи до перехода окраски в зелёную.

Примечание: смешанный индикатор готовят из 50мл раствора метиленблау (1г метиленблау в 800мл 93% этанола) и 100мл раствора метилрота.

Определение содержания белкового азота в биомассе.Навеску биомассы (0,2г) помещают в центрифужную пробирку и заливают 4мл 10% ТХУ. В содержимое пробирки, тщательно перемешивая стеклянной палочкой, добавляют ещё 4мл ТХУ и пробирку помещают в водяную баню на 30мин. ТХУ осаждает белки, а водорастворимые азотистые соединения переходят при этом в экстракт. После охлаждения пробирки оставляют при температуре 18 - 25°С ещё на 2 часа и затем центрифугируют при 5000 об/мин, в течение 15мин.

Центрифугат отбрасывают, а осадок количественно переносят в колбу Квельдаля, смывая небольшим количеством дистиллированной воды.

Дальнейшее определение содержания азота в белке проводят по вышеописанной методике.