В полиакриламидный гель

Цель работы:Ознакомление с технологией получения 6-аминопенициллановой кислоты гидролизом бензилпенициллина с помощью иммобилизованного фермента, овладение лабораторными навыками проведения процессов с иммобилизованными ферментами, определение выхода продукта.

6-Аминопенициллановая кислота (6-АПК) является полупродуктом в химическом синтезе ряда полусинтетических антибиотиков. Современная технология получения 6-АПК состоит из следующих основных стадий:

· получение биомассы клеток E.coli, содержащих фермент бензилпенициллинацилазу;

· выделение и очистка фермента;

· иммобилизация фермента в полиакриламидный гель;

· получение 6-АПК.

Последняя стадия включает в себя проведение следующих операций:

· гидролиз бензилпенициллина иммобилизованным ферментом;

· осветление гидролизной жидкости углем и отделение угля;

· осаждение 6-АПК в изоэлектрической точке;

· фильтрация и промывка полученного осадка 6-АПК водой и органическим растворителем;

· вакуум-сушка готового продукта.

Клетки E. сoli выращивают методом глубинной ферментации в течение 24 ч в слабощелочной среде, содержащей очищенный кукурузный экстракт и фенилуксусную кислоту, при 25°С при постоянном перемешивании и аэрации. По окончании ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости сепарацией или центрифугированием. Полученную пасту используют для извлечения фермента с помощью следующих технологических операций:

· экстракция пенициллинацилазы 0,9% раствором бутилацетата в воде при рН 8 и 40°С;

· отделение отработанных клеток фильтрацией;

· осаждение неактивных примесей (балластных белков) из бесклеточного экстракта при 5÷8°С путем добавления к экстракту сухого сульфата аммония до концентрации 20 мас.%, перемешивании в течение 30 мин и с последующим отделением балластных белков сепарацией или центрифугированием;

· осаждение активного белка-фермента и его отделение. Для этого к осветленному экстракту при 5÷8°С вновь добавляют сульфат аммония до уровня 12 мас.%, полученную смесь выдерживают 20 ч, при этом из экстракта выпадает осадок, содержащий преимущественно целевой фермент пенициллинацилазу;

· вакуум-сушка полученного фермента.

Приготовленный таким образом ферментный препарат подвергают иммобилизации в полиакриламидный гель.

Получение иммобилизованной пенициллинацилазы состоит в радикальной полимеризации акриламида и N,N¢-метилен-бис-акрил-амида в водной среде в присутствии инициаторов – персульфата аммония (NH4)2S2O8 N,N,N¢N¢-тетраметилендиамина. В реакционную смесь вводят бифункциональный реагент – глутаровый альдегид, под действием которого молекулы фермента ковалентно связываются с мономерами и сшиваются друг с другом.

Приготовление иммобилизованного фермента завершают промывкой полученного геля водой.

Процесс получения 6-АПК включает в себя последовательное проведение ряда вышеуказанных операций, выполнение которых и составляет экспериментальную часть данной лабораторной работы.