Ход работы. Культуру Asp. oryzae 8F выращивают глубинным способом

Культуру Asp. oryzae 8F выращивают глубинным способом. Минеральной основой во всех вариантах служит солевой набор среды Чапека (см. Приложение 2).

Варианты работы отличаются содержанием различных источников углерода: крахмал, соевая мука, кукурузная мука, мальтоза, сахароза. Все источники углерода добавляют к минеральной основе в количестве 5%, стерилизация среды при 100 кПа.

В качестве инокулята используют 2-х суточную культуру гриба, выращенную на 6-баллинговом сусле. Культивирование проводят в колбах на качалке при 120 об/мин в течение 120 ч при 30°С. Для каждого варианта работы выращивают по 4 колбы культуры (примерно 400 мл) на соответствующей среде.

Отдельно из каждой колбы выделяют мицелий, фильтруя содержимое через три слоя марли, причем первые порции фильтрата возвращают на фильтр. Мицелиальную массу отжимают, один из плотных комков мицелия используют для определения сухой массы, а второй – для определения активности внутриклеточной a-амилазы. Фильтраты же сливают вместе и используют для определения амилолитической активности культуральной жидкости.

Определение массы сухого мицелия гриба проводят с использованием прибора Чижовой. Сущность ускоренного метода определения влажности заключается в высушивании инфракрасными лучами навески вещества между двумя нагретыми металлическими плитами. Этот метод применяют для определения влажности сырья, биошрота неочищенных ферментных препаратов. Он прост, быстро воспроизводим, однако требует значительного расхода исследуемого материала – около 5 г. Ход анализа изложен в Приложении 1.

В связи с трудностью определения ферментов количественная характеристика их проводится косвенно и основана на трех основных принципах:

· определение наименьшего количества фермента, которое действует на определенное количество субстрата;

· определение продуктов реакции, полученных под влиянием фермента из данного количества субстрата;

· определение активности фермента по действию его на субстрат за определенный промежуток времени.

Для количественной характеристики a-амилазы используют ее свойство расщеплять амилозу крахмала (молекулярная масса ~110000) до амилодекстринов (молекулярная масса ~10000). Если амилоза с йодом дает синее окрашивание, то амилодекстрины – сине-фиолетовое. За единицу амилолитической активности принимают количество фермента, катализирующее гидролиз 1 г растворимого крахмала в строго определенных условиях – при 30°С, рН 4,7 в течение 60 мин. Экзогенную a-амилазу определяют в культуральной жидкости, из которой предварительно готовят ряд разведений – в варианте работы с сахарозой культуральную жидкость разводят в 2, 5, 10 раз, а в остальных вариантах – в 50, 100 и 200 раз.

Для определения амилолитической активности мицелия необходимо приготовить водную вытяжку. Для этого мицелий, собранный с одной из колб, отмывают на марлевом фильтре от остатков культуральной жидкости двумя порциями холодной воды (по 100 мл). Отжатый мицелий помещают в фарфоровую ступку, добавляют 10 мл забуференной дистиллированной воды (90 мл воды + 10 мл ацетатного буфера), 0,5÷1,0 г кварцевого песка и растирают 10÷15 мин. В растертую массу добавляют еще 10 мл забуференной воды и помещают ступку в термостат на 30 мин при 30°С. Целью этой операции является наиболее полное извлечение a-амилазы из мицелия. Затем содержимое ступки переносят на воронку со складчатым фильтром и промывают ступку и фильтр той же забуференной водой, доводя объем до 50 мл. Фильтрат используют для определения амилолитической активности.

Реакцию гидролиза крахмала ферментом проводят в пробирках с диаметром 10 мм. Берут 5 пробирок и подписывают 3 из них в соответствии с разведениями культуральной жидкости, одну используют для определения амилолитической активности в вытяжке из мицелия и одну – для контроля. Во все пробирки пипеткой вносят по 10 мл 1% раствора крахмала и помещают в ультратермостат на 10 мин при 30°С (При этой же температуре должны быть предварительно прогреты и все анализируемые ферментные растворы!!!). По окончании прогревания в три пробирки с крахмалом вносят по 5 мл соответствующих разведений культуральной жидкости, в 4-ю пробирку – 5 мл ферментной вытяжки, а в 5-ю (контрольную) – 5 мл дистиллированной воды; содержимое быстро перемешивают и пробирки помещают в ультратермостат точно на 10 мин.

За время экспозиции разливают в пробирки с d=18 мм по 10 мл рабочего раствора иода и подписывают их в соответствии с номерами пробирок опыта. Вынимают пробирки из ультратермостата и микропипетками, точно по 0,1 мл, переносят прогидролизованную крахмалодержащую среду из каждой пробирки опыта в соответствующую пробирку с иодом. Эту операцию проводят очень быстро и аккуратно, лишнюю жидкость с микропипеток следует удалять фильтровальной бумагой. Быстро перемешивают, при этом контрольная проба приобретает синий цвет, а опытные – различные оттенки фиолетового.

Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводят на ФЭК-56М в кюветах с рабочим расстоянием 10 мм при 630 нм (фильтр 9).

Количество прогидролизованного крахмала (с) определяют по формуле

с = 0,1∙(D1-D2)/D1,

где D1 и D2 – оптическая плотность контрольной и опытной проб;

0,1 – количество крахмала в реакционной смеси, г.

Концентрация (с) должна быть в интервале 0,02÷0,06. Если ни одна расчетная величина не удовлетворяет этому требованию, анализ повторяют, изменяя степень разведения ферментных растворов:

· если с<0,02, то реакция прошла плохо, следует проделать эксперимент, уменьшив разведение культуральной жидкости;

· если с>0,06 – фермент очень активен, следует проделать реакцию, увеличив разведение культуральной жидкости или ферментной вытяжки.

Расчет амилолитической активности ведут по специальному уравнению, подставляя в него найденное значение концентрации. Коэффициенты расчетного уравнения получены при математической обработке экспериментальных данных зависимости количества прогидролизованного крахмала от количества фермента.

Уравнение для расчета активности грибных амилаз А (ед.акт./мл), содержащихся в культуральной жидкости, имеет следующий вид :

А_кж = [(7,264∙с-0,03766)∙а]:V,

где с – количество прогидролизованного крахмала, г;

V – объем ферментного раствора, взятого для реакции, мл;

а – соответствующее разведение культуральной жидкости.

При расчете амилолитической активности мицелия АС (ед.акт./г) учитывают объем ферментной вытяжки и массу сухого мицелия:

А_{мицелия} = [(7,264∙c - 0,03766)∙50]:[V∙m],

где 50 – объем ферментной вытяжки, мл;

m – масса мицелия, г.

Обычно культуры микроорганизмов характеризуют по их продуцирующей способности, т.е. количеству целевого продукта, образованного 1 г биомассы.

В данной работе продуцирующая способность гриба выражается количеством единиц амилолитической активности на 1 г мицелия:

П_см = (SА_кж+SА_{мицелия}):m.

Полученные в работе экспериментальные и расчетные данные вносят в таблицу по форме:

Контрольные вопросы

1. Химическая природа ферментов, их классификация.

2. Как регулируется синтез ферментов у микроорганизмов?

3. Что такое катаболитная репрессия?

4. Что такое амилолитический комплекс?

5. Как измеряют количество фермента?

6. Общие принципы колориметрического метода определения амилолитической активности.

7. Что такое продуцирующая способность микроорганизма?