Ход анализа. Из бумаги вырезают два квадрата со стороной 12 см, складывают их по диагонали, загибают края

Из бумаги вырезают два квадрата со стороной 12 см, складывают их по диагонали, загибают края. Полученные таким образом пакеты помещают на 3 мин между нагретыми до 160°С плитами прибора Чижовой. После прогрева пакеты переносят для охлаждения в эксикатор и через 5 мин взвешивают на технических весах с точностью до 0,01 г. В заготовленные пакеты равномерно помещают биомассу гриба, собранную с двух колб, пакеты закладывают в прибор и высушивают в течение 6 мин при 160÷165°С. После охлаждения в эксикаторе пакеты с сухим мицелием взвешивают и по разности с массой пустых пакетов определяют массу мицелия, собранного с 200 мл среды, затем пересчитывают на 1 л.

Определения активности рибонуклеазы по Кальницкому

Метод основан на спектрофотометрическом определении кислоторастворимых продуктов гидролиза РНК.

Реактивы:

· РНК из дрожжей или ее натриевая соль (1%-й раствор в ацетатном буферном растворе).

· Кислота уксусная, 0,1 М раствор.

· Натрий уксуснокислый, 0,1 М раствор.

· Трихлоруксусная кислота, 50%.

· Натрий хлористый, ч.д.а.

· 0,1 М ацетатный буфер с рН 5,0 готовят путем смешивания 29,5 частей 0,1 М раствора уксусной кислоты с 70,5 частями 0,1 М раствора уксуснокислого натрия и добавляют 1,169 г хлорида натрия.

Ход анализа

В опытные центрифужные пробирки вносят по 1 мл исследуемого раствора, а в контрольную – 1 мл ацетатного буферного раствора. Все пробирки помещают в термостат с температурой 37±0,5^оС на 1÷2 мин. Затем в строгой последовательности в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора субстрата, подогретого до 37^оС. Отсчет времени проводят по секундомеру. После 4-х мин инкубации в каждую пробирку в той же последовательности добавляют по 1 мл 50%-й ТХУ (трихлоруксусной кислоты). Затем все пробирки помещают в ледяную баню на 15 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин.

Из каждой пробирки берут по 0,1 мл центрифугата, разбавляют дистиллированной водой до 3 мл, перемешивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 260 нм против дистиллированной воды.

Активность (А) выражают в единицах на мл анализируемого раствора и вычисляют по формуле:

А = (D_а-D_к)∙1000∙30,

где D_а – оптическая плотность анализируемого раствора при 260 нм;

D_к – оптическая плотность контрольного раствора при 260 нм;

30 – коэффициент разбавления супернатанта;

1000 – коэффициент перевода объема из мл в л.

Примечание

При получении значений оптических плотностей, больших 1,0, допускается разведение пробы дистиллированной водой непосредственно перед измерением.

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Питательные среды