Аффинная (биоспецифическая) хроматография

Аффинная хроматография - это метод очистки и разде­ления белков, основанный на их избирательном взаимо­действии с лигандом, ковалентно связанным с инертным носителем (иммобилизованный лиганд). В качестве лигандов используют соединения, взаимодействия которых с разделяемыми веществами основано на биологической функции последних. Так, при разделении ферментов лигандами служат их субстраты, ингибиторы или коферменты. Главная особенность, которая обусловливает высокую эффективность аффинной хроматографии, состоит в том, что разделение основано на различии не физико-химиче­ских признаков молекулы (заряда, формы и размера), а специфических функциональных свойств, отличающих данный фермент от множества других биополимеров.

Схематически (рис. 24.13) процесс разделения веществ с помощью аффинной хроматографии можно представить следующим образом. Колонку заполняют носителем, прочно связанным с каким-нибудь биологически актив­ным веществом (лигандом). Пропускают через колонку анализируемую смесь веществ, к одному из которых ли­ганд обладает биологическим сродством. Лиганд из всей смеси веществ выбирает «свое» вещество и образует с ним биоспецифический комплекс. В результате этого вещество останется в колонке связанным с лигандом, а все осталь­ные компоненты смеси пройдут через колонку, не задер­живаясь. После этого можно изменить буферный раствор, подобрав условия, при которых комплекс лиганда с избранным им веществом распадается и чистое вещество вы­мывается этим буферным раствором из колонки.

Рис. 24.13. Механизм аффинной хроматографии:

_

Л - лиганд; Л — иммобилизованный лиганд; М — биологически

_

активное вещество; МЛ - биоспецифический комплекс; ∆ - примеси; О - несорбирующиеся компоненты смеси

В настоящее время метод аффинной хроматографии применяется для выделения и очистки многих природных белковых молекул (антител, антигенов, ингибиторов, фер­ментов, гормонов, клеточных рецепторов), специфических пептидов, гликопротеидов и гликолипидов, полисахари­дов, моносахаридов, нуклеиновых кислот и нуклеотидрв, липидов, субклеточных частиц и многих видов клеток.

ВОПРОСЫ

1. Что такое хроматография?

2.Какие признаки положены в основу классификации хроматографических методов?

3. Что положено в основу адсорбционной хроматографии?

4. Какие адсорбенты, и растворители применяются в ад­сорбционной хроматографии?

5. От каких факторов зависит молекулярная адсорбция из растворов?

6. Где используется молекулярная адсорбция?

7. Что такое коэффициент распределения?

8. Какие варианты газовой хроматографии вы знаете? Что используется в газовой хроматографии в качестве по­движной фазы?

9. Из каких основных частей состоит газовый хромато­граф?

10. Что такое хроматограмма?

11. Как проводится анализ веществ методом тонкослойной хроматографии?

12. Как обнаруживаются разделяемые вещества в тонком слое сорбента и каким образом затем количественно оп­ределяются?

13. Что используется в качестве носителя неподвижной жидкой фазы в бумажной хроматографии?

14. Какие виды бумажной хроматографии различают в зави­симости от техники выполнения?

15. Что такое иониты? Напишите реакции ионного обмена на ионитах.

16. В каких отраслях народного хозяйства применяются ио­ниты?

17. С какой целью используется молекулярно-ситовая хроматография?

18. Что применяется в качестве носителей в молекулярно-ситовой хроматографии?

19. Какова главная особенность аффинной хроматографии в отличие от других хроматографических методов?

20. Для выделения и очистки каких веществ используется метод аффинной хроматографии?

ОТВЕТЫ НА ВОПРОСЫ ТЕСТОВОГО САМОКОНТРОЛЯ