Распределительная хроматография

Распределительная хроматография основана на разли­чии в растворимости разделяемых веществ в неподвиж­ной фазе (газожидкостная хроматография) или на разли­чии в растворимости веществ в подвижной и неподвижной жидких фазах. В последнем случае происходит перераспределение каждого вещества между двумя жидкими фазами в соответствии с его коэффициентом распределения К:

K = C₁ / C₂ , (24.17)

где С₁ - концентрация вещества в подвижной фазе; С₂ -концентрация вещества в неподвижной фазе. Наибольшее применение для разделения, анализа и исследования ве­ществ и их смесей, переходящих без разложения в парооб­разное состояние, получила газовая хроматография в обо­их ее основных вариантах: газожидкостном и газотвердо­фазном (газоадсорбционном).

В газовой хроматографии в качестве подвижной фазы (газа—носителя) используется инертный газ: гелий, азот, ар­гон, значительно реже водород и углекислый газ. В качестве адсорбентов (неподвижной фазы) применяют оксид алюми­ния, активированные угли или полимерные сорбенты.

Газохроматографический процесс обычно осуществляют в специальных приборах, называемых газовыми хромато­графами. Общая схема хроматографа приведена на рис. 24.9.

Рис. 24.9. Принципиальная схема газового хроматографа:

1 - устройство для ввода пробы в хроматографическую колонку (дозатор); 2 - хроматографическая колонка; 3 - детектор (анализирующая система); 4 - регистратор

Поток газа-носителя из баллона непрерывно подается в хроматографическую колонку, а оттуда в детектирую­щее устройство. Оно непрерывно измеряет концентрацию компонентов у выхода из колонки и преобразует ее в элек­трический сигнал, регистрируемый потенциометром. На

Рис. 24.10. Хроматограмма искусственной смеси аминокислот, входящих в состав продуктов гидролиза белков:

1 - аспарагиновая кислота; 2 - треонин; 3 - серии; 4 - глютаминовая кислота; 5 - пролин; 6 - глицин; 7 - аланин; 8 - цистин; 9 - валин; 10 - метионин; 11 - изолейцин; 12 - лейцин; 13 - тирозин; 14 - фенилаланин; 15 - гистидин; 16 - лизин; 17 - аммиак; 18 - аргинин

ленте самописца получается выходная кривая, которую называют хроматограммоа (рис. 24.10).

Полученная хроматограмма обычно представляет со­бой ряд пиков. Площадь пика пропорциональна количест­ву каждого компонента, а время выхода пика при посто­янном режиме работы прибора (постоянная температура колонки и скорость газа-носителя) характеризует приро­ду компонента. Таким образом, на одном приборе можно проводить не только разделение, но и качественный и ко­личественный анализ смесей.

Современный хроматограф может включать несколько колонок и различные детекторы, а также автоматическое устройство для подготовки и ввода пробы. Подсоединен­ный к хроматографу компьютер, имеющий запоминаю­щее устройство и банк хроматографических данных, обес­печивает аналитика богатой информацией.

Метод газохроматографического анализа очень чувст­вителен. Для его проведения часто вполне достаточно не­скольких кубических миллиметров газа, долей микролит­ра жидкости или долей микрограмма твердого вещества.

Газовая хроматография находит широкое применение в медицине для определения содержания многочисленных ле­карственных препаратов, определения уровня жирных кис­лот, холестерина, стероидов и т.д. в организме больного.

В методе тонкослойной хроматографии (ТСХ) непо­движная твердая фаза тонким слоем наносится на плас­тинку из стекла, алюминиевой фольги или полиэфирной пленки. В качестве сорбента в ТСХ применяют силикагели, оксид алюминия, крахмал, целлюлозу и другие веще­ства с высокой адсорбционной способностью. Выбор рас­творителя зависит от природы сорбента и свойств анали­зируемых соединений. Часто применяют смеси раствори­телей из двух или трех компонентов.

Пробу анализируемой жидкости в виде пятна или полосы наносят на стартовую линию (а) в 2-3 см от края плас­тинки (рис. 24.11).

Рис. 24.11. Схема определения величины

R при хроматографировании

в тонком слое

Нанесение пробы осуществляют микропипетками, ми­крошприцами или специальными приспособлениями. Край пластинки погружают в растворитель (или систему растворителей), который действует как подвижная фаза. Под действием капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит ком­поненты смеси, что приводит к их разделению.

Движение зон компонентов разделяемой смеси количе­ственно характеризуется величиной R, которая называет­ся индексом удерживания. За R принимают отношение расстояния L₁, пройденного зоной вещества от стартовой линии до центра зоны, к расстоянию L₂, пройденному растворителем за то же время (L₂ равно расстоянию от старто­вой линии до границы фронта растворителя (в) к концу опыта):

Понятно, что L_l не может быть больше L₂ и значения R лежат в пределах от нуля до единицы. Стандартное веще­ство («свидетель») в том же растворителе наносится на стартовую линию рядом с анализируемой пробой и, таким образом, хроматографируется в тех же условиях. Влияние различных факторов на все вещества будет одинаковым, поэтому совпадение R компонента пробы и одного из «сви­детелей» дает основания для отождествления веществ с учетом возможных наложений. Несовпадение R интерпре­тируется более однозначно, оно указывает на отсутствие в пробе соответствующего компонента.

По окончании хроматографирования хроматограмму высушивают и проявляют химическим или физичес­ким способом. При химическом способе пластинку оп­рыскивают раствором реактива, взаимодействующего с компонентами смеси. При обработке, например, пара­ми йода четко проявляются органические соединения. В физических способах проявления используется спо­собность некоторых веществ флуоресцировать под действием ультрафиолетового излучения. Вещества, обла­дающие радиоактивным излучением, обнаруживаются методом радиоавтографии с помощью различных фото­материалов.

Количественные определения в ТСХ могут быть сдела­ны или непосредственно на пластинке, или после удале­ния вещества с пластинки. При непосредственном опре­делении на пластинке измеряют тем или иным методом площадь пятна (например, с помощью миллиметровой кальки) и по заранее построенному градуировочному гра­фику находят количество вещества. Применяют также прямое спектрофотометрирование пластинки с помощью спектроденситометров. Наиболее точным считается ме­тод, в котором вещество после разделения удаляется с пластинки и анализируется спектрофотометрическим или иным методом.

В бумажной хроматографии в качестве носителя непо­движной жидкой фазы используется специальная хроматографическая бумага из чистой целлюлозы.

Последняя содержит гидроксильные группы, которые удерживают возле себя полярный растворитель. Чаще всего это вода, которая играет роль неподвижной жидкой фазы. Органические растворители являются подвижной фазой. К ним обычно предъявляются следующие требова­ния: растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться, состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться, растворите­ли должны легко удаляться с бумаги.

При нанесении проб анализируемой смеси вещества, на­ходящиеся в ней, увлекаются растворителем и одновремен­но происходит распределение компонентов смеси. Более по­лярные компоненты располагаются ближе к линии старта, неполярные компоненты продвигаются дальше. Таким об­разом можно провести качественно идентификацию раз­личных соединений в присутствии стандартов («свидете­лей») или по числовому значению R каждого компонента.

По технике выполнения различают одномерную и дву­мерную бумажную хроматографию. Для получения дву­мерных хроматограмм хроматографирование производят дважды во взаимно противоположных направлениях: по­сле обработки пробы одним растворителем хроматограмму поворачивают на 90° и хроматографируют вторично уже другим растворителем. Такая методика позволяет проводить более тонкие разделения компонентов смеси.

Количественные определения, как и в ТСХ, выполня­ются по площади пятна и интенсивности его окраски. Не­редко хроматограмму разделяют на отдельные части по числу пятен. Каждое пятно обрабатывают соответствую­щим органическим растворителем или смесью раствори­телей. Вещество, перешедшее в органический слой, опре­деляют любым подходящим методом: фотометрическим, электрохимическим и др.