Этапы приготовления постоянного гистологического препарата

1. Взятие материала. Размеры объекта 7х7х3 мм не более

1см³. Материал должен быть свежим. Во время взятия материала необходимо избегать лишней его травматизации;

2. Фиксация материала. Фиксация производится путем погружения объекта в фиксирующую жидкость. Цель этого этапа - закрепление гистохимических структур в том состоянии, в котором они находились при жизни. Для фиксации используют фиксаторы, которые могут быть простыми и сложными. Простые - спирты (этиловый, метиловый), формалин, соли тяжелых металлов, кислоты (уксусная, пикриновая, осмиевая). Сложные - фиксаторы, состоящие из нескольких простых в определенном соотношении. Фиксаторы должны обладать бактерицидными свойствами.

3. Промывка проводится для удаления фиксатора из объекта в проточной воде в течение 24 часов.

4. Обезвоживание объекта. Для этого используют спирты возрастающей концентрации от 60⁰ до 100⁰.

5. Уплотнение объекта - осуществляется последовательно в несколько этапов: парафин, целоидин, синтетические смолы. Эта процедура еще носит название заливки.

6. Изготовление срезов - для этого используются микротомы и ультрамикротомы. С помощью микротомов готовятся тонкие (5-7 мкм) и полутонкие (0,5-1 мкм) срезы, ультрамикротомы позволяют приготовить ультратонкие срезы ( 0,005-0,2 мкм)

7. Окраска или контрастирование срезов. Необходима для того, чтобы можно было различать структурные детали объекта, большинство которых не имеет природного контраста. Перед окраской срезы депарафинируются ксилолом, потом ксилол удаляют при помощи батареи спиртов нисходящей концентрации от 100⁰ до 60⁰ и промываются водой. После этого на препарат наносится раствор красителя, затем краска удаляется водой.

8. Заливка срезов канадским бальзамом с целью длительного хранения препаратов. Этот этап также состоит из нескольких стадий, включающих: обезвоживание в спиртах возрастающей концентрации (от 60⁰ до 100⁰), осветление в ксилоле, заливка среза тонким слоем канадского бальзама, покрытие покровным стеклом.

Для окраски препаратов используется целый ряд различных красителей. Все гистологические красители в зависимости от происхождения делятся на:

1) растительные; 2) животные; 3) синтетические.

ЁК растительным красителям относится - гематоксилин.

ЁК животным относится - кармин.

ЁВсе остальные красители являются синтетическими. Это - эозин,

фуксин, азур и другие.

По химическим свойствам все красители делятся на:

1) кислые; 2) основные; 3) нейтральные; 4) специальные.

Кислые - это красители, свойства которых определяются наличием химических групп - СООН, - НSO^-₃, - Н₂РО^-_3. Их еще называют анионными, они окрашивают цитоплазму. К этой группе относится эозин, ясный зеленый. Гистологические структуры, которые окрашиваются кислыми красителями называются оксифильными (ацидофильные, эозинофильные).

Основные - это катионные красители и подавляющее большинство их в своем составе имеет атом азота с положительным зарядом. Эти красители избирательно окрашивают ядра клеток и поэтому их называют ядерными. К таким красителям относятся гематоксилин, кармин, сафранин. Гистологические структуры, которые окрашиваются основными красителями называются базофильными.

Необходимо отметить, что они способны окрашивать и цитоплазму в тех случаях, когда в ней содержится большое количество ДНК и нуклеиновых кислот или кислых гликозаминогликанов.

Нейтральные - образуются при соединении водных растворов кислого и основного красителей, например: эозиново-кислый, метиленовый синий. Гистологические структуры, которые одновременно воспринимают и кислые и основные красители называются нейтрофильными или полихроматофильными. Некоторые гистологические структуры способны изменять цвет основного красителя. Это явление получило название метахромазии. Метахроматически красится зернистость базофильных лейкоцитов, межклеточное вещество хрящевой ткани.

Специальные красители, которые используют для окрашивания определенных веществ, структур или тканей. Это судан III - красит жировую ткань, орсеин - эластические волокна.