Физико-химические методы исследования сополимеров

Состав полученных сополимеров определяли, используя методы элементного анализа, обращая внимание на соотношение С/N [11], Фурье-ИК (FTIR) и ¹Н ЯМР [13], а также проводили потенциометрическое титрование водным раствором щелочи.

В случае применения метода ¹Н ЯМР спектроскопии следует учесть, что для поли-МА характерно наличие очень широкого сигнала в области 5-3 м. д. [22]. Из данных табл. 1.2 следует, что в спектрах сополимеров, включающих звенья ВП и МА возможно наложение сигналов всех звеньев в области 5-3 м. д.

Таблица 1.2 – Химические сдвиги сигналов в спектрах ЯМР ¹Н полимеров и сополимеров МА и ВП

Полимер	Н1	Н2	Н4,5	Н3,6
Поли-МА [22]	5-3
ВП-МА [13]	4.45-4.08	1.83-1.30	2.33-1.84 (Н5)	3.95-3.56 (Н3) 3.54-2.95(Н3,6)
Поли-ВП		1.7-1.1	2.45-1.7	4.2-2.8

Сополимер МА с ВП при гидролизе ангидридных звеньев образует полимерную двухосновную кислоту, обладающую полиэлектролитными свойствами. Поэтому кислотно-основное титрование часто используется для определения содержания звена малеинового ангидрида в его сополимерах с различными сомономерами (например, [22]), при этом более точное определение конечной точки достигается с применением потенциометриии. Для проведения титрования можно выделить образовавшийся в результате гидролиза сополимер малеиновой кислоты (МК) [11, 23-25] или сразу анализировать его в растворе [8, 26, 27]. Единой методики гидролиза сополимеров МА для подготовки их к потенциометрическому титрованию на данный момент нет.

На кривой титрования сополимера ВП с MA в водном растворе [11, 24, 25], как и при титровании сополимера стирола с МА [27] наблюдали один перегиб (рис. 1.4), соответствующий нейтрализации половины карбоксильных групп. Отмечалось [24], что вид кривой титрования несколько "стертый, поэтому больше информации дают кривые зависимости ΔpH/ΔV и Δ²pH/ΔV² от объема титранта NaOH (V).

Рисунок 1.4 – Кривая потенциометрического титрования водного раствора гидролизованного сополимера стирола с МА 0,1н КОН [27].

Наличие одного перегиба на кривых титрования сополимеров МА в водных растворах соответствует теоретическим представлениям о соотношении констант первой и второй ступеней диссоциации, согласно которым кислоты, у которых отношение К₁/К₂ меньше 10⁴, титруются как одноосновные [28]. Так как величина К₁/К₂ для малеиновой и янтарной кислот равна 20200 и 19 [29], на кривых потенциометрического титрования водного раствора МА (МК) имеются два скачка, а в сополимерах малеиновой кислоты оттитровывается одна группа.

Для раздельного титрования обеих карбоксильных групп могут быть использованы органические основания и амиды, среди которых доступным и широко применяемым в аналитической практике является ДМФА [28]. В работе [30] было показано, что при титровании сополимера МА и стирола в среде ДМФА наблюдаются два четких перегиба, соответствующие первым и вторым карбоксильным группам звеньев гидролизованного МА. Смешивание органических растворителей, подобных ДМФА, с водой способствует еще большему различию кислотных свойств [28], а также препятствует образованию осадков, образующихся в процессе взаимодействия веществ в первоначально гомогенных средах, и снижает вязкость раствора.

Для определения молекулярной массы сополимеров зачастую применяют вискозиметрический метод [31]. В качестве меры вязкостных свойств линейных макромолекул используют так называемую характеристическую вязкость [η] - предельное значение отношения η_уд/С при концентрации раствора С, стремящейся к нулю. Здесь η_уд – величина удельной вязкости, которую находят по соотношению времени истечения ра[η] створа t и растворителя t₀ : η_уд = (t – t₀)/t₀. Характеристическую вязкость [η] определяют путем графической экстраполяции значенийη_уд/С, полученных для нескольких концентраций, к нулевой концентрации [31]. Для полимеров с низкими или средними молекулярными массами зависимости η_уд/С от С, как правило, прямолинейны.

Вискозиметрический метод широко используют для определения молекулярного веса поливинилпирроолидона (ПВП). Поскольку этот полимер хорошо растворяется в воде, все измерения производят обычно в водных растворах. [1]

Для определения молекулярной массы пользуются нелинейным уравнением Марка - Хувинка, выражающим зависимость [η] от молекулярной массы (М):

[η] = K M^α, (1.1)

где K и α — константы для данной системы полимер-растворитель при определенной температуре.

Обычно в зависимости от природы растворителя величина α, определяющая степень свернутости макромолекулы, колеблется в пределах 0,5-0,8. [31]. Так, для ПВП найдено [32]:

[η] = 1.94 10^-2 M^0.64 в хлороформе;

[η] =5.31 10^-2 M^0.(5) в воде.

Совершенно другая зависимость вязкости от концентрации наблюдается для растворов полиэлектролитов в полярных растворителях (например, полимерные кислоты в воде). Зависимость опять приобретает линейный характер при добавлении нейтральной соли к водному раствору полиэлектролита (например, 5% хлорида натрия). Это вызвано тем, что при добавлении низкомолекулярной соли к раствору полиэлектролита степень диссоциации его становится постоянной, и, таким образом, увеличение жесткости цепей, т. е. повышение вязкости при уменьшении концентрации полимера в растворе, предотвращается.

Авторами [24, 33] было установлено, что при работе с сополимерами ВП-МА целесообразно подавлять диссоциацию поликислоты, используя в качестве растворителя сильную низкомолекулярную кислоту. Так, было показано [24], что поли(N-ВП-со-MК) проявляет характер неэлектролита в разбавленном водном растворе HCl (0,0085 М) при 25°С, что соответствует рН = 2.1 (рис. 1.5), так что для характеристики сополимера стали пригодными обычные методы (рассеяние света, вискозиметрия).

Рисунок 1.5 – Зависимость приведенной вязкости от концентрации для образца поли(N-ВП-со-MК) в HCl при рН 2.1 [24].

В этом случае уравнение Марка - Хувинка имеет вид:

[η] = 3.25·10^-4 × М^0.62 (1.2)

Таким образом, изучение спектроскопии, рН-метрии и вискозиметрии сополимеров ВП с МА представлено единичными работами и требует более подробного исследования.

1.2. Биологическая активность (со)полимеров N‑винилпирролидона

(Со)полимерам N-винилпирролидона (ВП) присуще сочетание высокой гидрофильности, способность к комплексообразованию, отсутствие токсичности, хорошие адгезионный свойства, что позволяет использовать их в различных целях. Несмотря на то, что активные исследования в этой области проводятся не менее 70 лет, находятся новые области применения полимеров на основе ВП. Кроме того, продолжается изучение механизма взаимодействия этих полимеров с белковыми соединениями, низко- и высокомолекулярными соединениями, способными к образованию комплексов со звеньями ВП. Данные таких публикаций позволяют судить о новых перспективах использования и большой практической ценности данных (со)полимеров.

Благодаря своим уникальным свойствам поливинилпирролидон (ПВП) широко применяется в медицинской практике. Информация, относящаяся к применению ПВП в медицине до 1997 г., изложена в монографиях и обзорах, например [1-4]. ПВП входит в число биологически активных полимеров с неспецифической активностью, образующих комплексы с широким кругом низко- и высокомолекулярных соединений за счет водородных связей, гидрофобных и других нековалентных взаимодействий. Этот полимер нетоксичен, доза LD₅₀ при пероральном и внутривенном применениях составляет ~ 100 и 10-15 г/кг соответственно [3]. Он не подвергается метаболизму в живом организме и его выведение зависит от молекулярной массы (ММ) и способа введения. Стойкость к биодеструкции обуславливает жесткие требования к ММР ПВП для внутривенного введения, поскольку макромолекулы ПВП с ММ ≤ 25 тыс. и 25-110 тыс. выводятся в течение нескольких дней и нескольких месяцев соответственно, а с ММ ≥ 110 тыс. задерживаются на годы и могут индуцировать патологические процессы [2].

Сополимеры на основе N-винилпирролидона широко используются в медицине и представляют большой интерес в качестве физиологически активных веществ лекарственного назначения. При этом важно как получение образцов с определенным значением молекулярной массы, так и стабильный состав, а также контроль композиционной однородности.

В Институте фармацевтических технологий (Россия, Москва) ведутся работы по синтезу сополимеров N-винилпирролидона с 2-метил-5-винилпиридином (МВПр) и 2-метил-5-винилтетразолом (МВТАз) в широком диапазоне соотношений исходных мономеров и изучению их биологической активности [34]. Показано, что эти сополимеры обладают выраженной физиологической активностью, увеличивающейся с повышением доли звеньев МВПр или МВТАз, тогда как с повышением доли звеньев ВП улучшается растворимость сополимера в воде. Результаты исследования показали [35-37], что оба сополимера не токсичны: за 7 суток наблюдения не погибло ни одно животное, которому ввели 0,4 мл раствора, содержащего 10 мас.% сополимера.

Оптимальными свойствами обладает сополимер, содержащий 64 мол.% ВП и 36 мол.% МВПр, с М_w=46.6 кДа, получивший торговое название СовидонTM [34-39]. Показано [39], что введение раствора сополимера в виде глазных капель способствуют уменьшению митотического индекса клеток эпителия роговицы мышей и крыс, поврежденной радиационным воздействием. Наилучший эффект достигается при использовании 10 %-ного раствора Совидона, вводимого сразу после облучения.

Увеличение доли звеньев МВТАз в его сополимерах с ВП способствует появлению и усилению иммунодепрессантных (или иммуностимулирующих) свойств сополимера [36, 37], а также противолучевой эффективности [37]. Найдено, что сополимеры с содержанием звеньев МВТАз до 70±5 мол.% могут быть использованы в качестве радиопротекторов [37].

Более того, указанные сополимеры обладают свойствами активаторов фагоцитоза [36, 38]. Обнаружено, что введение их внутримышечно в дозах 5 и 50 мг/кг в объеме 250 мкл увеличивало фагоцитарную активность на 15-45% по сравнению с контролем в исследованиях с красителем Нейтрофильным красным, а также повышало индекс завершенности фагоцитоза на 85-138% в исследованиях с частицами коллоидной туши.

Кроме того, сополимеры ВП с МВТ и с МВП со средневязкостной молекулярной массой (М_µ) 30-50 и 15-28 кДа соответственно обладают противораковой активностью [36]: они в 1.5-2.4 раза увеличивают торможение роста опухоли (саркома М-1, саркома 45, карциносаркома Уокера, аденокарцинома толстого кишечника) по сравнению с продигиозаном. Активность ВП с МВП с М_µ 15-28 кДа оказалась в среднем в ~ 1.5 раз выше, чем с М_µ ~ 40 кДа [40].

При индуцировании подострого поражения введением подопытным белым крысам дозы нитрата плутония-239 (407 кБк/кг) найдено [36], что пероральное введение указанных сополимеров способствует улучшению состояния животных по показателям общего анализа крови: существенно менее выражена лейкопения, снижено содержание эритроцитов, повышен уровень гемоглобина.

Кроме того, установлено [34, 36], что указанные сополимеры в концентрациях от 0,01 до 10 мкг/мл крови повышают продуцирование обеих форм интерлейкина-1 (ИЛ-1), но при этом не оказывают существенного влияния на продуцирование интерлейкина-2 и фактора некроза опухоли-альфа. Таким образом, можно предположить, что они опосредованно препятствуют пролиферации раковых клеток, задействуя, в частности, механизм фагоцитоза. Кроме того, сополимеры, как показано авторами [36], могут быть полезны в комбинированной терапии в сочетании с другими соединениями, повышающими продуцирование ИЛ-1, а также с лекарственными формами самого ИЛ-1.

Обнаружено, что сополимеры N-винилпирролидона (или других N-виниламидов) с (мет)акрилоил- или кротоноилсорбозой, получаемые радикальной сополимеризацией с последующем гидролизом в водном растворе муравьиной кислоты, имеют весьма высокий уровень иммуностимулирующей активности [41]. Он существенно превышает выявленный ранее иммуностимулирующий эффект, которым обладают сополимеры ВП с метакрилоил- или кротоноил амидоглюкозой [42].

Установлено [43], что сополимеры ВП с диметиламино­метилметакрилатом, а также ВП с диметиламинометилметакрилатом и винилбутиловым эфиром проявляют выраженную детоксицирующую активность по отношению к эпихлоргидрину, что выражается в увеличении выживаемости животных (белые крысы-самцы и мыши).