Доклад защиты

(1) Глубокоуважаемые председатель, члены комиссии и все присутствующие, вашему вниманию предлагается доклад по дипломной работе на тему «Теоретическое и экспериментальное обоснование состава конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H. рylori».

(2) Работа выполнена на кафедре микробиологии Вятского государственного университета.

(3) Иммунохроматографический анализ с успехом используется для диагностики возбудителей инфекционных заболеваний. Применение его для диагностики хеликобактериоза актуально как для первичной диагностики, так и для контроля эффективности лечения. Основные компоненты и принцип работы иммунохроматографических тест-систем представлены на слайде (3).

(4) На сегодняшний день самым распространенным маркером в мембранных системах иммуноанализа является коллоидное золото. Для конъюгации с маркером приоритет отдают моноклональным антителам. Конъюгат маркера с антителами является основным компонентом иммунохроматографической тест-системы, от которого зависит специфичность и чувствительность анализа.

(5) В связи с этим, целью исследования явилось теоретическое и экспериментальное обоснование состава конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H. рylori.

(6) Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи, представленные на слайде (6):

— теоретически обосновать и экспериментально отработать методику приготовления наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм;

— с использованием метода электронной микроскопии и спектрофотометрии провести оценку полученных серий коллоидного золота и выбрать кондиционные серии коллоидного золота;

— провести оценку адсорбционной способности серий коллоидного золота с моноклональными антителами;

— теоретически и экспериментально обосновать состав конъюгата коллоидного золота с антителами для разработки иммунохроматографической тест-системы, предназначенной для идентификации H.pylori.

Методы синтеза коллоидного золота можно условно разделить на две большие группы: дисперсионные и конденсационные. Наиболее изученными и воспроизводимыми методами являются конденсационные методы с использованием в качестве восстановителя цитрата натрия - метод Туркевича и метод Френса.

(7) Метод Френса более распространен благодаря возможности получения наночастиц золота заданного размера. При анализе литературы были найдены различные модификации метода Френса.

(8) Известна формула для расчета необходимого количества цитрата натрия для получения коллоидного золота с заданным диаметром частиц.

(9) Однако, сравнительный анализ научно-исследовательских работ показал, что указанная формула используется не всегда, что подтверждается данными таблицы.

Отсутствие четких рекомендаций по приготовлению коллоидного золота обосновывает целесообразность в рамках одной из задач дипломной работы отработать методику получения наночастиц коллоидного золота с размером 30 нм.

(10) На первом этапе работы оценили влияние оборотов мешалки на процесс получения частиц заданного размера и времени кипячения с момента появления красной окраски до окончания эксперимента.

В результате проведенного эксперимента в образцах коллоидного 4 и 4/1, а также 6 и 6/1 на следующий день наблюдалось небольшое выпадение осадка. В сериях 4/1, 5/1, 6/1 по результатам электронной микроскопии количество конгломератов было несколько больше.

(11) Для дальнейшей работы были выбраны два условия, при применении которых была получена лучшая серия коллоидного золота – 5: обороты мешалки - 500 об/мин и время стабилизации частиц после появления красной окраски раствора в процессе варки коллоидного золота 20 мин.

(12) На втором этапе мы учли водность золотохлористоводородной кислоты и произвели пересчет ее количества для эксперимента. Кроме этого, были отработаны условия внесения раствора золотохлористоводородной кислоты, а также был установлен необходимый интервал времени для внесения реагентов относительно появления первых признаков закипания деионизированной воды. При приготовлении коллоидного золота серий 8 и 8/1, 10 и 10/1 отличался режим скорости перемешивания растворов в процессе варки.

(13) При визуальной оценке серий 8 и 8/1 раствор, в котором находятся частицы, имеет синий цвет, полученные частицы по данным электронной микроскопии неоднородны по форме и размеру, образуют большое количество конгломератов, на графиках спектрофотометрии отсутствует четко сформированный пик поглощения. Перечисленные характеристики свидетельствуют о некондиционности указанных серий.

(14) Серии коллоидного золота 10, 10/1, 12, 12/1 однородны по форме и размерам. Серию 10 от серии 10/1 и серию 12 от серии 12/1 отличает большая однородность частиц и оптимальная, близкая к 1 ЕД, оптическая плотность раствора коллоидного золота, характерная для серий 10/1 и 12/1.

(15) Все вышеуказанные признаки дали нам основание отобрать серии 10, 10/1, 12, 12/1 для дальнейшей оценки их способности адсорбировать антитела на своей поверхности.

Таким образом, по результатам первой части работы экспериментально отработана методика приготовления наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм. Алгоритм приготовления частиц с заданным размером представлен на слайде 15.

(16) Вторым иммунохимическим компонентом конъюгата с частицами коллоидного золота являются антитела к искомому антигену – H.pylori.

Проведя анализ имеющихся на рынке антител к H. pylori, с учетом ограниченных финансовых возможностей, для работы были отобраны антитела, основные характеристики которых представлены на слайде 16.

(17) С выбранными моноклональными антителами 1811 и 387 провели постановку реакции по определению концентрации антител, наиболее оптимальной для посадки на коллоидное золото серий 10, 10/1, 12, 12/1. Методика постановки реакции по определению «золотого числа» представлена на данном слайде. Результаты постановки реакции определяли визуально и на спектрофотометре.

(18) Результаты визуальной оценки реакции определения золотого числа для моноклональных антител 1811 с сериями коллоидного золота 10, 10/1, 12, 12/1 представлены на слайде.

Оптическую плотность содержимого лунок измеряли на планшетном спектрофотометре при длине волны λ = 630 нм. По результатам определения строили кривую зависимости оптической плотности содержимого лунок от концентрации антител.

(19) Из данных, представленных на слайде, следует, что точка выхода на горизонтальную прямую соответствует концентрациям моноклональных антител: для клона 1811 – 3,125 мкг·см^-3, для клона 387 – 12,5 мкг·см^-3.

По результатам визуальной оценки и спектрофотометрии были определены серии коллоидного золота с наибольшей адсорбционной способностью – 10/1 и 12/1, а также выбраны моноклональные антитела 387 для последующей посадки на наночастицы коллоидного золота соответствующих серий препаратов.

(20) Для моноклональных антител 387 был выбран диапазон концентраций антител от 25 мкг·см^-3 до 7 мкг·см^-3, в пределах которого провели раститровку антител с шагом 2 мкг·см^-3_.

Из данных, представленных на рисунке, следует, что «золотое число» для моноклональных антител 387 и серии коллоидного золота 10/1 соответствует 17 мкг·см^-3, для моноклональных антител 387 и серии коллоидного золота 12/1 соответствует 19 мкг·см^-3. С учетом данных литературы необходимая концентрация для адсорбции соответствующих антител должна составлять, соответственно, 19,5 мкг·см^-3 и 23,0 мкг·см^-3.

(21) Характеристика серий КЗ 10/1 и 12/1, отобранных для приготовления конъюгатов с моноклональными антителами, представлена на данном слайде.

(22) По результатам данной работы можно сделать следующие выводы:

1. Отработана методика приготовления наночастиц коллоидного золота с диаметром 30 нм.

2. Экспериментально получено 12 серий препарата коллоидного золота.

3. Проведена оценка полученных серий коллоидного золота, кондиционными признаны серии 10, 10/1, 12, 12/1 с размером частиц от 15 до 30 нм.

4. Определена адсорбционная способность четырех серий коллоидного золота с выбранными моноклональными антителами к Сag белку H.pylori – клоны 1811 и 387.

5. Обоснован состав конъюгата коллоидного золота с антителами: серии коллоидного золота 10/1 и 12/1 и моноклональные антитела к Сag белку H.pylori клон 387 с концентрацией, соответственно, 19,5 мкг•см^-3 и 23 мкг•см^-3.

(24) Исходя из вышесказанного, можно вынести следующие практические предложения:

- Использовать разработанную схему синтеза наночастиц коллоидного золота с размером 30 нм при изготовлении иммунохроматографических тест-систем для идентификации Helicobacter pylori;

- подготовить проект статьи для публикации в научно-практическом журнале.

(24) Результаты работы опубликованы в виде тезисов на Всероссийской научной конференции «Наука – производство – технологии – экология» в апреле 2015 г.

(25) Автор выражает глубокую благодарность своему дипломному руководителю д.м.н. Богачевой Наталье Викторовне и магистранту кафедры микробиологии Мокрецовой Ирине Михайловне за помощь в выполнении дипломной работы.