Методы стерилизации

Цель процесса стерилизации состоит в полном удалении или уничтожении всех живых микроорганизмов и спор внутри или на поверхности предмета. Стерилизации подвергаются питательные среды, лабораторная посуда, инструменты, растворы и т. д. Можно выделить термическую и холодную стерилизацию.

К методам термической стерилизации относят: прокаливание и обжигание в пламени спиртовки; кипячение; сухожаровую (горячим паром) стерилизацию; стерилизацию насыщенным паром под давлением (автоклавирование); дробную стерилизацию (тиндализацию), пастеризацию.

Прокаливание и обжигание в пламени – наиболее быстрые и доступные методы стерилизации. Однако их использование ограничивается только термоустойчивыми материалами. Такими методами стерилизуют бактериологические петли, иглы, шпатели, пинцеты, предметные и покровные стекла, фарфоровые ступки и другие инструменты.

Кипячение – простейший способ стерилизации. Кипячением в дистиллированной воде стерилизуют мембранные фильтры. Режим стерилизации для мембранных фильтров – 30 – 60 мин с момента энергичного закипания воды. Металлические инструменты, мелкие стеклянные детали лучше всего кипятить в специальных закрытых приборах – стерилизаторах.

В микробиологической практике таким способом стерилизации пользуются редко в связи с тем, что продолжительное кипячение может повредить обрабатываемый материал, а сокращение времени кипячения может не обеспечить стерильности.

Дробная стерилизация (тиндализация или стерилизация текучим паром) используется для стерилизации питательных сред и растворов, которые портятся при использовании температур выше 100 °С. Метод разработан в 1877 году Дж. Тиндалем и согласно этому методу, жидкость доводят до 100 °С и продолжают выдерживать при этой температуре 10 мин. За это время все вегетативные клетки погибают, жизнеспособными остаются только споры. Затем жидкость охлаждают до температуры, оптимальной для прорастания спор (30 °С) и через несколько часов снова пропускают пар. Двух-трех подобных циклов обычно бывает достаточно для уничтожения всех имеющихся спор. Эффективность этого метода особенно велика потому, что нагревание обычно приводит к активации спор. Тиндализацию проводят либо с помощью пара, подаваемого от внешнего источника, либо в специальных аппаратах. Резервуар с кипящей водой расположен в нижней части аппарата, над ним расположена сетка с устанавливаемыми стерилизуемыми растворами.

Пастеризация заключается в однократном прогреве материала при температурах ниже 100 °С и направлена на уничтожение вегетативных клеток. Этот метод широко используется в пищевой промышленности для обработки продуктов, которые теряют вкусовую и пищевую ценность при кипячении: молока, ягодных и фруктовых сиропов, соков, вин, пива и т. д. В микробиологической практике пастеризацией пользуются для получения накопительных культур спорообразующих бактерий. В лабораторных условиях пастеризацию проводят либо на водяной бане, либо в ультратермостате при следующих режимах: 60 – 70 °С в течение 15 – 30 мин; 80 °С в течение 10 – 15 мин.

Сухожаровая стерилизация или стерилизация сухим горячим воздухомпроводится в сушильных шкафах. Режим стерилизации:
160 – 170 °С на протяжении 2 часов. При этом предполагается, что погибают как клетки, так и споры. Таким способом стерилизуют стеклянную посуду, инструменты и др.

Стерилизация насыщенным паром под давлением или автоклавирование – один из наиболее эффективных методов стерилизации, так как стерилизуемый объект подвергается одновременному воздействию как высокой температуры, так и повышенному давлению пара. Погибают как вегетативные клетки, так и споры микроорганизмов. Процесс проводится в специальных приборах – автоклавах, закрывающихся герметично. Основные используемые режимы стерилизации следующие: 15 – 30 мин при избыточном давлении 0,5 атм (температура достигает 110 – 112 °С); 15-45 мин при избыточном давлении 1,0 атм. (температура достигает 121 °С); 10 – 30 мин при избыточном давлении 1,5 атм. (температура достигает 126 °С). Таким способом стерилизуют питательные среды, растворы, посуду, инструменты, фильтры и т. д.

При холодной стерилизации используют химические вещества или проводят воздействие на объект факторами физической природы. Химические методы подавления жизнедеятельности микроорганизмов предполагают использование дезинфектантов и антисептиков, имеющих неспецифический эффект, либо использование антибиотиков и синтетических антимикробных препаратов с избирательным противомикробным действием. Дезинфицирующие вещества классифицируются по группам: кислоты или щелочи, галогены, тяжелые металлы, четвертичные аммониевые основания, фенольные соединения, альдегиды, кетоны, спирты, амины и перекиси. Устойчивость микроорганизмов к их действию может существенно меняться в зависимости от таких факторов как концентрация активного компонента, длительность контакта, рН, температура, влажность, и присутствие органического вещества. Химические средства неспецифического действия используются для обработки помещений, оборудования, различных предметов. Например, спирты используются в концентрации 60 – 70 % и эффективны в отношении вегетативных клеток. Фенолы и их производные применяются для дезинфекции помещений, дезинсекции.

Среди используемых летучих стерилизующих веществ можно указать на окись этилена, окись пропилена, озон, метилбромид, формальдегид, глютаровый альдегид. Указанные вещества могут быть использованы для стерилизации пластмассовых центрифужных пробирок, пластмассовых чашек Петри, оптических инструментов, сыворотки крови и др.

Стерилизация фильтрованием используется для веществ, которые не выдерживают термической обработки (растворов белков, углеводов, витаминов, углеводородов, антибиотиков, сыворотки). Способ заключается в пропускании жидкостей и газов через специальные мелкопористые фильтры (бактериальные), диаметр пор которых не превышает 0,45 – 0,2 мкм. Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их матрикса. Для пропускания раствора через фильтр требуется вакуум или давление. Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембранные. Глубинные состоят из волокнистых или гранулированных материалов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в матриксе фильтра. Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру и захват ими частиц определяется размером пор. Фильтры содержат различные природные (коалин, асбест, целлюлоза) или синтетические (производные целлюлозы) материалы. Различают фильтры: мембранные, получаемые на основе нитроцеллюлозы; асбестовые или фильтры Зейтца, получаемые на основе смеси асбеста и целлюлозы; фарфоровые или свечи Шамберлана, получаемые из смеси кварцевого песка и коалина, сплавленных между собой; стеклянные, полученные из стекла «Пирекс».

Стерилизация с использованием облучения пригодна для термолабильных материалов. Ультрафиолетовые лучи (250 – 270 нм) используются для стерилизации центрифужных пробирок, наконечников для пипеток, материалов из термолабильной пластмассы. Время облучения определяется мощностью лампы, временем воздействия, степенью и видовым составом микроорганизмов загрязненного материала. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры, которые в 3 – 10 раз более устойчивы. От УФ-облучения микроорганизмы могут быть защищены органическими веществами, пылью или другими защитными оболочками. Ограничением при использовании данного метода стерилизации является низкая проникающая способность УФ-лучей и высокая поглощающая способность воды и стекла. Рентгеновское и g-облучение также эффективно для стерилизации пластмасс, пищевых продуктов, но требует строгого соблюдения правил безопасности. Наиболее чувствительны к g-облучению вегетативные клетки бактерий, затем идут плесневые грибы, дрожжи, бактериальные споры и вирусы.

На практике проводят и контроль стерилизации, при котором о работе стерилизующих агентов и аппаратов судят по: 1) эффективности гибели спор в процессе стерилизации; 2) прямым измерением температуры и 3) с помощью химических индикаторов.