Микробиологической лаборатории

Аппараты и приборы.Термостаты предназначены для выращивания микроорганизмов на питательных средах при постоянной заданной температуре. В лаборатории устанавливают несколько термостатов с разной температурой, благоприятной для развития отдельных групп микроорганизмов: мезофилов -28-30⁰С, термофилов - 43-55⁰С, патогенных видов - 37⁰С.

Автоклавы служат для стерилизации посуды, питательных сред и других материалов насыщенным паром под давлением выше атмосферного.

Сушильный шкаф с терморегулятором предназначен для сушки и стерилизации лабораторной посуды, для высушивания различных материалов до постоянной массы.

Холодильник используют для хранения при температуре около +4⁰С музейных и рабочих культур микроорганизмов, питательных сред, некоторых реактивов и растворов.

Рефрактометр используют для определения содержания сухих веществ, сахаров, спиртов, аминокислот, витаминов, экстрактивных веществ.

Посуда. Для микробиологических исследований необходима различная стеклянная посуда. Чашки Петри применяют для выделения чистых культур, количественного учета микроорганизмов, анализа микрофлоры на плотных питательных средах и других исследований; колбы Виноградского, плоские бутыли – матрацы, качалочные колбы для выращивания аэробных микроорганизмов, пробирки и колбы с поплавками - для изучения процессов брожения. Кроме специальной микробиологической посуды широко используют обычную химическую посуду.

Инвентарь. В микробиологической практике применяют петли, иглы, пинцеты, ножницы, сверла для пробок, металлические цилиндры для пипеток, проволочные или металлические корзины с отверстиями для стерилизации пробирок и др.

Петли и иглы изготовляют из платиновой или хромоникелевой проволоки, которую впаивают в стеклянные или металлические держатели. Свободный конец проволоки аккуратно загибают в виде петли с плотно прижатым концом, иначе жидкость в кольце не будет удерживаться.

Основные принципы метода электронной микроскопии

Разрешающая способность светового микроскопа ограничена длиной световых волн. Максимально возможное разрешение равно полови­не длины волны используемого света. Таким образом получить изображение объекта размером меньше, чем эта величина невозможно. Средняя величина волны видимого света составляет примерно 550 нм, поэтому в конце ХIХ века могли получить разрешение примерно 200 нм (разрешение - это расстояние, на котором две течки видны раз­дельно). Незначительное увеличение разрешающей способности было достигнуто благодаря изобретению ультрафиолетового микроскопа длина волны УФ-света составляет 250 нм), обеспечивающего разре­шение в 100 нм.

Однако многие клеточные структуры имеют меньшие размеры. Эта проблема была решена в тридцатые годы, когда созда­ние электронного микроскопа произвело революцию в биологической науке. Вместо светового излучения в электронном микроскопе ис­пользуют пучок электронов, у которых длина волны значительно меньше, следовательно, и разрешающая способность значительно больше. Длина волны зависит и от напряжения, подаваемого для генерации электронного пучка, но практически можно, получить разре­шение в 0.5 нм, т.е. примерно в 500 раз больше, чем в световом микроскопе. Создаваемое увеличение достаточно, чтобы различить крупные молекулы. Лимитирующим фактором в достижении большего увеличения стало и остается до сих пор не усиление разрешающей способности микроскопа, а методы подготовки образца для исследо­вания.

В сущности, принцип действия электронного микроскопа таком же, как и светового, в котором пучок световых лучей направляется линзой конденсора через образец, а полученное изображение затем увеличивается с помощью линз.

При работе на электронном микроскопе оператор сидит лицом к колонне, по которой проходит лучок электронов. Источник электронов находится в верхней части колонны, а сам образец - внизу. На вольфрамовую нить накала подается высокое напряжение (около 50000 В), и нить накала излучает поток электронов. Чтобы сфокусировать эти электроны, необходимы уже не стеклянные линзы, а электромаг­ниты. Внутри колонны создается глубокий вакуум, чтобы сократить до минимума рассеивание электронов из-за столкновения с частицами воздуха и происходящее за этот счет нагревание.

Втрансмиссионном (просвечивающем) микроскопе электроны проходят через образец, поэтому для изучения можно использовать только очень тонкие об­разцы. Части образца с относительно высокой молекулярной массой в наибольшей степени вызывают рассеяние электронов, поэтому для увеличения контрастности образцы пропитывают (окрашивают) тяжелы­ми металлами (свинец или уран). Электроны невидимы для человечес­кого глаза, поэтому они направляются на опалесцирующий экран, ко­торый воспроизводит видимое изображение, или же непосредственно на фотопленку, чтобы получить постоянный фотоснимок (электронную микрофотографию).

Различные приемы подготовки к исследованию

1. Окрашивание ультратонких срезов тяжелыми металлами. Срезы готовятся на ультратоме и окрашиваются соединениями тяжелых метал­лов, как нитрат свинца, уранилацетат или осмиевая кислота. Окрашенные участки становятся непроницаемы для электронов, и. на мик­рофотографиях они выглядят темными.

2. Негативное контрастирование. При негативном контрастировании окрашивается фон, тогда как сам образец остается неокрашенным. Этот метод особенно удобен при изучении деталей строения поверх­ности мелких частиц, таких как рибосомы, вирусы, фрагменты изоли­рованных органелл и мембран, так как краситель проникает между деталями поверхностного строения.

3. Напыление. Образец бомбардируется атомами тяжелых металлов, например, золотом или платиной, в определенном направлении. Поверхность образца покрывается слоем металла, непроницаемого для
электронов. Закрытые площади ("тени") не покрываются металлом и
остаются прозрачными для электронов. Таким образом, образец оказывается на фотографии черным, а закрытые площади белыми. Так как человеческий глаз лучше воспринимает и интерпретирует темные от­печатки, используют обычно негативы фотографий. Напыление используют также для выявления поверхности мелких частиц (вирусов и пр.)

4. Замораживание-скалывание и замораживание – травление. Фрагмент ткани быстро замораживается при очень низкой температуре и затем разламывается спомощью очень тонкого лезвия. Ткань трескается вдоль слабо соединенных плоскостей, которыми часто являются мемб­раны. Затем, лед возгоняется, оставляя сколотую поверхность.

Реплика этой поверхности создается откладывающимся на ней слоем углерода. На эту реплику из углерода напыляется тяжелый ме­талл, а ткани под репликой быстро разрушаются синильной кислотой. Этот метод очень удобен для изучения структуры мембраны. Его преимущество состоит в том, что ткани быстро умерщвляются, не подвергаясь химической обработке, которая может повлиять на структуру. Вполне вероятно, что клетки сохраняют свою прижизненную форму.