Студопедия

КАТЕГОРИИ:

АстрономияБиологияГеографияДругие языкиДругоеИнформатикаИсторияКультураЛитератураЛогикаМатематикаМедицинаМеханикаОбразованиеОхрана трудаПедагогикаПолитикаПравоПсихологияРиторикаСоциологияСпортСтроительствоТехнологияФизикаФилософияФинансыХимияЧерчениеЭкологияЭкономикаЭлектроника


Молекулярные механизмы генных, хромосомных и геномных мутаций




 

Мутационная изменчивость у человека. Молекулярные механизмы генных мутаций. Классификация генных мутаций. Понятие о моногенных наследственных заболеваниях. Молекулярные и цитологические механизмы хромосомных мутаций. Современные методы изучения кариотипа человека: дифференцированное окрашивание, FISH-метод и др. Классификация мутаций по причинам возникновения. Мутагенные факторы, методы определения мутагенной активности веществ. Антимутагенез. Генеративные и соматические мутации.

 

Мутационная изменчивость у человека. Стабильность генетического аппарата и обусловливаемый этим аппаратом консерватизм наследственности — лишь одна сторона наследственности. Другая её сторона, столь же неотъемлемая от живого, как и первая, — изменчивость. В совокупности наследственность и изменчивость обеспечили и сохранение жизни на Земле, и непрекращающуюся биологическую эволюцию. Наследственная изменчивость организма обеспечивает необходимую ему приспособляемость к условиям существования как в пределах жизни одного индивида, так и в рамках существования биологического вида в целом. Наследственное многообразие человека — результат длительной эволюции живой материи. При этом надо иметь в виду особенности эволюции человека как биологического и социального существа. У человека как социального существа естественный отбор со временем протекал всё в более специфических формах, что, безусловно, расширяло наследственное разнообразие популяций. Сохранялось то, что могло «отметаться» у животных, или, наоборот, терялось то, что нужно животным. Например, более полноценное обеспечение себя пищей и возможность удовлетворять потребность в витамине С позволили человеку в процессе эволюции «утерять» ген L-гулонолактоноксидазы, катализирующей у животных синтез аскорбиновой кислоты. Наличие этого гена у животных страхует их от развития цинги, а человек из-за такой «всеобщей врождённой ошибки метаболизма» подвержен авитаминозу С. В процессе эволюции человек «приобретал» и нежелательные признаки, имеющие прямое отношение к патологии человека. Большинство видов животных невосприимчиво к дифтерийному токсину и вирусу полиомиелита, потому что у животных отсутствуют компоненты мембраны клеток, обеспечивающие восприятие того или другого патогенного фактора. У человека эти компоненты есть. Гены, их детерминирующие, уже идентифицированы. Например, для восприятия дифтерийного токсина такой ген локализован в 5-й, для вируса полиомиелита — в 19-й хромосоме.

Большинство мутаций увеличивает полиморфизм человеческих популяций (группы крови, цвет волос, рост, разрез глаз и др.), но иногда мутации затрагивают жизненно важные функции, а это уже приводит к болезни. Таким образом, наследственная патология — часть наследственной изменчивости, накопившейся за время эволюции человека. Человек, став биологическим видом Homo sapiens (Человек разумный), как бы заплатил за «сапиентацию» своего вида накоплением патологических мутаций. На основе этих положений формулируется одна из главных концепций медицинской генетики об эволюционном накоплении патологических мутаций в человеческих популяциях. Подтверждением этой концепции являются патологические мутации у животных, по своим проявлениям сходные с наследственными болезнями у человека (ахондроплазии. гемофилии, мышечные дистрофии и др.), а также наличие наследственных болезней у людей, живших несколько тысячелетий назад (о чём можно судить по находкам патологических скелетов в раскопках и произведениям искусства).

Эволюция любого вида, в том числе и человека, в конечном счете, сводится к эволюции генотипа. В биологической эволюции человека болезнь как фактор естественного отбора могла играть существенную роль, а эволюция генотипа в свою очередь меняла нозологию патологических процессов. Зависимость эволюции болезни от эволюции генотипа вряд ли может вызывать сомнение. Выше были приведены конкретные формы этой зависимости (цинга, дифтерия, полиомиелит). Факторы эволюции в течение длительного времени влияли не только на формирование биохимических, иммунологических, физиологических или морфологических свойств организма, но и на его патологические реакции, обусловливая значительно большее многообразие нозологических форм болезней у человека по сравнению с таковыми у животных.

Основным источником многообразия наследственных признаков и их непрекращающейся эволюции служит мутационная изменчивость. Способность ДНК мутировать сложилась в эволюции и закрепилась отбором, по-видимому, так же, как и способность противостоять мутационным изменениям, т.е. репарировать их. В организации ДНК заложена возможность ошибок её репликации наряду с возможностью изменения первичной структуры. Вероятность «сбоя» в точности репликации молекулы ДНК невелика: она составляет 10-5—10-7. Однако, принимая во внимание исключительно большое число нуклеотидов в геноме (3,2 х 109 на гаплоидный набор), следует признать, что в сумме на геном клетки на одно её поколение приходится несколько мутаций в структурных генах. По мнению разных авторов, каждый индивид наследует 2—3 новые вредные мутации, которые могут давать летальный эффект или подхватываться отбором, увеличивая генетическое разнообразие человеческих популяций.

Изменение нуклеотидной последовательности молекулы ДНК может отразиться на первичной (аминокислотной) структуре белка или на регуляции его синтеза. Так, большой опыт изучения молекулярной природы мутаций гемоглобина показывает, что значительная часть таких мутаций не изменяет функции гемоглобина. Такие мутации нейтральны и не подвергаются отбору. Другие мутации приводят к функциональным отклонениям в молекуле белка. Эти отклонения в каких-то условиях жизни организма могут оказаться полезными, т.е. иметь адаптивное значение, поэтому сохранятся, а иногда и умножатся в последующих поколениях. Именно таким путём возникали и сохранялись в популяциях разнообразные варианты структурных, транспортных и ферментных белков организма. Свойственный организму человека широкий белковый полиморфизм, благодаря которому каждый индивид биохимически неповторим, обусловлен исходно мутационной изменчивостью и отбором адаптивных белковых вариантов.

Однако, если структурные отклонения несовместимы с выполнением белком его функции, а она жизненно важна для клетки (организма), мутация становится патологической и в дальнейшем либо исключается из популяции вместе с нежизнеспособной клеткой (организмом), либо сохраняется, обусловливая наследственную болезнь. В отдельных случаях гетерозиготные носители патологической мутации подвергаются положительному отбору. Примером этого служит ген серповидно-клеточной анемии, который широко распространился в популяциях, проживающих в эндемичных по малярии районах, вследствие большой устойчивости гетерозиготных носителей «аномального» гена (мутантного аллеля) к малярийному плазмодию.

Различные признаки организма по-разному устойчивы к мутационным изменениям, что связано, по-видимому, со значением признака и с его эволюционным «возрастом». Такие признаки, как гистоновые белки, входящие в состав хромосом, или сократительные белки актин и тубулин, или ферментные белки репликации и транскрипции, весьма консервативны и одинаковы не только у разных представителей человечества, но и у биологических видов значительной филогенетической отдалённости. По-видимому, мутации в соответствующих генах детальны. Большинство белков организма, особенно ферментных, существуют в нескольких изоформах и подвержены таким мутационным изменениям, которые ведут к патологии.

Патологические мутации различны по способности сохраняться и распространяться в популяциях. Одни из них, позволяющие их носителю сохранять плодовитость и не вызывающие серьёзных неблагоприятных сдвигов в фенотипе, могут передаваться из поколения в поколение длительное время. Такие признаки сегрегируют (распределяются) в поколениях согласно законам Менделя, и обусловленный ими генетический груз в популяциях может долго сохраняться. Некоторые комбинации условно патологических рецессивных аллелей могут давать селективное преимущество индивидам (выживаемость, плодовитость). Частота таких аллелей в популяции будет повышаться до определённого уровня в ряду поколений, пока не наступит равновесие между интенсивностью мутационного процесса и отбора. Частота разных мутантных аллелей этого рода может быть неодинаковой в различных популяциях, что определяется популяционными закономерностями (эффект родоначальника, частота кровнородственных браков, миграция и экологические условия). Под эффектом родоначальника подразумевают накопление патологических мутаций в ограниченной популяции от одного носителя болезни группе потомков.

Если вновь возникшая мутация имеет доминантное патологическое проявление и ведёт к летальному генетическому исходу (индивид не оставляет потомства), то такой мутационный груз не передаётся следующему поколению. Это обычно доминантные формы тяжёлых болезней, а также большая часть хромосомных болезней.

В целом эффекты генетического груза у человека выражены в эволюционно- генетических явлениях сбалансированного полиморфизма, летальности и сниженной фертильности.

На основе постоянно протекающих процессов изменения наследственности (мутаций) и отбора генотипов при длительной эволюции человека в популяциях сформировался сбалансированный полиморфизм. Под этим названием понимают такое явление, когда в популяции представлены две формы аллелей одного гена или более, причём частота редкого аллеля составляет не менее 1%. Поскольку возникновение мутаций — редкое событие (1 х 10-7), то, следовательно, частоту мутантного аллеля в популяции более 1% можно объяснить только каким-то селективным преимуществом этого аллеля для организма и постепенным накоплением в ряду поколений после его появления. Примерами сбалансированного полиморфизма являются группы крови АВО, резус, гены муковисцидоза, фенилкетонурии, первичного гемохроматоза. Генетическое многообразие человека основано на сбалансированном полиморфизме, формировавшемся в течение десятков и сотен тысячелетий. Такое многообразие — основа развития человека как биологического вида. Вероятность возникновения и фиксации в популяциях какой-либо мутации с положительным эффектом в эволюционно «отлаженном» человеческом организме существует и в настоящее время, но она крайне мала. Практически новые мутации всегда дают отрицательный эффект.

К эффектам мутационного груза относится летальность. Она проявляется гибелью гамет, зигот, эмбрионов, плодов, смертью детей. Наиболее интенсивно летальные эффекты выражены в человеческих популяциях на уровне зигот. Примерно 60% зигот погибает до имплантации, т.е. до клинически регистрируемой беременности. Исходы всех клинически зарегистрированных беременностей распределяются следующим образом: спонтанные аборты — 15%, мертворождения — 1%, живорождения — 84%. Из 1000 живорождённых детей не менее 5 умирают в возрасте до года по причине наследственной патологии, несовместимой с жизнью. Таков объём летального груза мутационной изменчивости в популяциях человека с медицинской точки зрения.

Для большинства наследственных болезней характерна сниженная фертильность, обусловленная нарушением репродуктивной функции. Это ведёт к уменьшенному воспроизводству потомства (и больного, и здорового) в семьях с наследственной патологией.

Медицинские и социальные последствия мутационного процесса: социальная дизадаптация (инвалидность) больных, повышенная потребность в медицинской помощи и сниженная продолжительность жизни.

Молекулярные механизмы генных мутаций.Генетический материал — ДНК — очень лабилен. Он может меняться, мутировать в результате как внешних, так и внутренних воздействий. Ито­гом возникающих изменений, если они происходят в со­матических клетках (а они происходят непрерывно с са­мой первой минуты существования нового человеческо­го организма — зиготы — до последней минуты его жиз­ни), являются многочисленные болезни, включая рако­вые опухоли и, по-видимому, старение и смерть. Если же они происходят в клетках полового пути, то возникают мутации, которые могут в процессе эволюции закрепляться и распространяться в популяции и приводить к полиморфизму, если они не отсеиваются в силу случай­ных причин или в силу их вредного воздействия на жиз­неспособность индивидуума и его потомства.

В целом разнообразие генов зависит от скорости мутаций, разме­ра и демографической истории популяции, в которой происходят мутации, времени, в течение которого про­исходит накопление этих различий и селекции. Степень разнообразия, которое может поддерживаться в попу­ляции, прямо пропорциональна ее размеру. Сравни­тельно небольшая вариабельность в популяции чело­века (вариабельность генома шимпанзе — нашего бли­жайшего родственника — значительно выше, чем у че­ловека) является результатом ее молодого возраста и происхождения от сравнительно небольшой началь­ной популяции.

Вредные мутации постоянно возникают, но быстро отсеиваются из популяции. Существует баланс между вновь возникающими мутациями и их отсеиванием се­лекцией. В результате вредные мутации, вызывающие болезнь, обладают двумя свойствами: они встречаются редко, и каждая конкретная мутация, существующая в популяции, возникла недавно. Что касается обычного полиморфизма, то механизм его поддержания в популя­ции, несмотря на длительную и интенсивную дискуссию по этому поводу, неясен и, возможно, прояснится, когда удастся достаточно быстро и сравнительно недорого сравнивать множество геномов и провести корреляции между частотами определенных аллелей и историями различных популяций.

В молекулах ДНК могут происходить изменения последовательности нуклеотидов. Такие изменения, если они затрагивают функционально активные гены, могут приводить к нарушениям метаболизма или функций (признаков). Если эти изменения не приводят к гибели организма или клетки — они могут передаваться по наследству. Следовательно, генные мутации — это стабильные изменения структуры генов, повторяющиеся в последующих циклах репликации и проявляющиеся у потомства в виде новых вариантов признаков. Все разновидности мутаций связаны с изменением нуклеотидной последовательности генов.

Классификация генных мутаций. По особенностям структурных изменений можно отметить несколько групп разнообразных мутаций:

· замена одних азотистых оснований другими (транспозиция) (рис.33.);

· изменение количества нуклеотидных пар в структуре гена (дупликация, инсерция, делеция);

· изменение порядка последовательности нуклеотидов в составе гена (инверсии);

· разрыв цепей;

· образование сшивок.

 

Замена азотистых оснований. Причинами этого рода мутаций являются:

а) ошибки репликации,

б) влияние определенных химических агентов.

Под воздействием химических агентов может происходить нарушение структуры азотистого основания уже присоединенного нуклеотида. Например, под воздействием азотистой кислоты может происходить самопроизвольное дезаминирование цитозина. В результате этого цитозин превращается в урацил. В дальнейшем в цикле репликации урацил соединяется аденином, который в следующем цикле присоединяет тимидиновый нуклеотид.

Еще одной причиной может быть ошибочное включение в образующуюся цепь ДНК нуклеотида с измененным основанием. Если это остается незамеченным ферментами репарации, измененное основание включается в процесс репликации, что может привести к замене основной пары на другую.

 

 

 

Рис.33. Схема возникновения мутации (транспозиции) по механизму замены одного азотистого основания другим

 

Мутации в результате замены азотистых оснований возникают первоначально в одной из цепей ДНК. Если они не исправляются в ходе репарации, то при последующих репликациях они закрепляются в обеих цепях молекулы. Следствием этого является образование нового триплета в генетическом коде ДНК. Это может отразиться на первичной структуре кодируемого белка, его пространственной организации и функции. Изменения первичной структуры пептида не произойдет в том случае, если новый триплет является «синонимом» прежнего, т. е. будет кодировать ту же аминокислоту. Например, аминокислота лейцин кодируется шестью триплетами: УУА, УУГ, ЦУУ, ЦУЦ, ЦУА, ЦУГ. Замена одного из нуклеотидов в этих триплетах не изменит его «смысла». Этот пример демонстрирует биологическое значение избыточности генетического кода. Однако в большинстве случаев замена одной аминокислоты на другую приводит к серьезным последствиям. Например, замена глутаминовой кислоты валином в молекуле гемоглобина приводит к изменению его структуры и функций. В результате этого у человека развивается болезнь — серповидно-клеточная анемия. В ряде случаев замена азотистых оснований может приводить к появлению нонсенс-кодонов некодирующих аминокислот. Следствием этого будет досрочное прерывание процесса синтеза. Считается, что замена азотистых оснований приводят в - 25 % случаев к образованию триплетов-синонимов, в ~ 5 % случаев — к образованию нонсенс- кодонов, и в ~ 70 % — к возникновению генных мутаций.

Изменение количества нуклеотидов в гене. Эта мутация — результат выпадения (делеции) или вставки (инсерции) одной или нескольких пар нуклеотидов в молекулу ДНК (рис. 34). Такой тип мутаций встречается довольно часто. Указанное изменение происходит вследствие воздействия на ДНК некоторых химических агентов, а также радиоактивного облучения. Результатом этой мутации является сдвиг рамки считывания информации с генетического кода. Следствием этого является синтез полипептидов с измененной аминокислотной последовательностью, нарушение структуры и функций белков, нарушение фенотипа. Однако если количество восстановленных или утраченных нуклеотидов кратно трем, то сдвиг рамки не происходит. В этом случае в белке может появиться лишняя аминокислота или будет на одну меньше. Одной из причин мутаций, приводящих к изменению количества нуклеотидов, являются вставки или делеции в результате активности подвижных генетических элементов. Это определенные нуклеотидные последовательности, встроенные в геномы многих организмов. Эти структуры ДНК способны самопроизвольно менять свое положение в результате ошибок при рекомбинации.

 

 

Рис.34. Схема изменения количества нуклеотидов

 

Изменение нуклеотидной последовательности гена (инверсия). Этот тип мутации связан с поворотом определенного участка ДНК на 180°. Такие нарушения происходят вследствие действия химических агентов и ряда физических факторов на молекулярно-генетические
процессы репликации и рекомбинации. Следствием этого является нарушение нуклеотидной последовательности гена. Это приводит к изменению первичной структуры полипептида, нарушению структуры и функции белка, нарушению фенотипа.

Разрывы одной из цепей могут происходить под действием ионизирующей радиации, в результате повреждения химических связей между нуклеотидами (рис. 35). Дефекты могут восстанавливаться ферментом лигазой.

 

 
 

 

 

Рис.35. Схема возникновения мутации в результате инверсии

 

Сшивка нуклеотидов, например, двух рядом стоящих тиминов, происходит под действием ультрафиолетового облучения. Это приводит ошибкам транскрипции.

«Мутон». Этим термином называют минимальное количество генетического материала, способного к мутации, что приводит к появлению нового варианта признака. В вышеизложенном материале приведены шовные типы мутаций. Во всех случаях видно, что достаточно изменить только одну пару комплементарных оснований в гене, чтобы ценить свойства белка. То есть мутон соответствует одной паре комплементарных нуклеотидов.

Рекон. Этим термином называют минимальное количество генетического материала, изменение которого в результате рекомбинации кроссинговера приводит к мутации и появлению нового варианта признака. Такие процессы могут приводить к сдвигу рамки считывания нарушению синтеза необходимого белка. Научные исследования побывают, что достаточно рекомбинации одной пары комплементарных нуклеотидов, чтобы произошла мутация. Следовательно, рекон соответствует одной паре комплементарных нуклеотидов.

Множественные аллели. Различные структурно- фунциональные варианты гена называют аллелями. Они отличаются небольшими изменениями в нуклеотидной последовательности. Это обеспечивает вариации в проявлении признака. Аллели располагаются в одних и тех в участках (локусах) гомологичных хромосом. Наличие в генофонде популяции более двух вариантов аллельных генов называют множественными аллелями. Причиной множественного аллелизма являются разнообразные мутации и рекомбинации. Мутации могут происходить в любых участках гена. Они приводят к тому, что один и тот же ген может участвовать в нескольких вариантах. Если мутации не вызывают гибель организма, они сохраняются в генофонде вида, чем обусловливают появление нового варианта признака в популяции.

Моногенные наследственные болезни.Большинство форм наследственных заболеваний обусловлено генными мутациями, т.е. молекулярными изменениями на уровне ДНК (муковисцидоз, гемофилия, фенилкетонурия, нейрофиброматоз, миопатия Дюшенна и т.д.). Это генные болезни.

Мутации транскрибируемых участков (определяющих аминокислотную последовательность в молекуле синтезируемого белка) приводят к синтезу аномального продукта, в то время как мутации нетранскрибируемых областей могут приводить к снижению скорости синтеза незаменимого белка разной степени выраженности. Фенотипически генные мутации могут проявляться на молекулярном, клеточном, тканевом и органном уровнях.

Множественность метаболических путей, функций белков в организме, ограниченность наших представлений о нормальном метаболизме затрудняют разработку обоснованной этиологической классификации генных болезней. Даже число генных болезней можно определить только ориентировочно (3500— 4500), потому что нет строгих критериев нозологических форм ни с клинической, ни с генетической точки зрения. Например, с клинической точки зрения миопатии Дюшенна (тяжёлая) и Беккера (лёгкая). являются разными формами, а с генетической точки зрения это результат мутации в одном и том же локусе. Установлено, что миопатия Дюшенна развивается при полной блокаде, а Беккера — при частичной блокаде синтеза РНК для дистрофина (при миопатии Беккера делеции гена по размеру меньше).

Более точно можно говорить о тех генах, в которых идентифицированы болезнь- обусловливающие мутации. В настоящее время известно около 1100 таких генов. Однако можно ожидать, что в ближайшее время на основе знаний генома человека процесс обнаружения генов и мутаций в них будет ускорен. В связи с тем, что различные мутации в одном и том же гене часто приводят к отличающимся нарушениям, общее число болезней с установленной мутационной природой можно считать равным 1500.

Унаследование патологического гена (а в случае рецессивных мутаций — двух аллелей) не всегда сопровождается развёрнутой клинической картиной. Выше уже говорилось о возможном влиянии факторов внешней среды на проявление генов. Однако и другие гены, формирующие генотип особи, т.е. генетическую конституцию индивида, могут модифицировать проявление патологического гена. В таких случаях говорят о неполной пенетрантности и варьирующей экспрессивности. Поскольку генетическая среда для патологического гена всегда индивидуальна, возникают широкие возможности для разного проявления этого гена у различных индивидов.

Многие генные мутации обусловливают возникновение таких молекулярных форм белков, патологическое действие которых выявляется не в обычных условиях, а только при взаимодействии со специфическими факторами внешней среды. Это так называемые экогенетические варианты. Например, у лиц с мутациями в локусе глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы при лечении сульфаниламидами возникает гемолиз эритроцитов, у лиц с аномальной холинэстеразой введение дитилина приводит к длительной остановке дыхания.

В связи с большим числом нозологических форм генных болезней, их редкостью, неполной клинической и патологоанатомической диагностикой наследственной патологии данные по распространённости наследственных болезней носят ещё отрывочный характер. Однако по формам, по которым проводятся массовые диагностические или профилактические программы, собран убедительный материал для суждения об эпидемиологии генных болезней.

Общая частота новорождённых с генными болезнями в популяциях в целом составляет примерно 1%, из них с аутосомно-доминантным типом наследования — 0,5%, аутосомно-рецессивным — 0,25%, Х-сцепленным — 0,25%; Y-сцепленные и митохондриальные болезни встречаются крайне редко.

Распространённость отдельных форм болезней колеблется от 1:500 (первичный гемохроматоз) до 1:100 000 и ниже (гепатолентикулярная дегенерация, атаксия-телеангиэктазия и др.).

Распространённость генной болезни условно можно считать высокой, если 1 больной встречается на 10 000 новорождённых и чаше, средней — 1:10 000— 1:40 000, низкой — очень редкие случаи. В группу распространённых входит не более 15 генных болезней, но они обусловливают почти 50% обшей частоты больных с наследственной патологией.

Мутационный процесс — одна из биологических характеристик любого вида. Он постоянно протекает у человека в зародышевых и соматических клетках и является основой возникновения и поддержания генетического разнообразия человека. В то же время это первичный источник возникновения наследственных болезней. По разным оценкам, частота возникновения мутаций (спонтанный уровень) у человека ориентировочно составляет 1 х 10-3—1 х 10-7 генов на поколение, т.е. мутационные события в каждом гене достаточно редки. Лишь в нескольких генах мутации возникают с повышенной частотой (1 на 104 гамет). Эти гены отличаются от других необычайно большими размерами (360 000 пар нуклеотидов в гене нейрофиброматоза и 2х106 — в гене миопатии Дюшенна—Беккера).

Таким образом, текущий мутационный процесс на генном уровне в одном поколении не может обеспечивать наблюдаемой высокой частоты патологических аллелей в популяциях. По приблизительным косвенным оценкам (а точные прямые пока невозможны) общий вклад мутационного процесса в распространённость наследственных болезней составляет около 20% их общего числа.

 

 

 

Рис.36. Схемы различных хромосомных аберраций

 

Молекулярные и цитологические механизмы хромосомных мутаций. Такие мутации связаны с изменением структуры и размеров хромосом. Их также называют хромосомными перестройками или хромосомными аберрациями. Нарушение структуры хромосом является следствием нарушения процессов кроссинговера, мейоза или митоза, а также действием других факторов, приводящих к образованию фрагментов. Такие фрагменты могут в дальнейшем даже воссоединиться, но без восстановления нормальной структуры. Различают внутри- и межхромосомные перестройки. Среди внутрихромосомных аберраций

выделяют следующие (рис.36.): делеция — нехватка внутренних участков хромосом; дупликация — удвоение участков хромосомы; инверсия — поворот участка хромосомы на 180°; транслокация — перемещение участка из одного места хромосомы в другое.

Причинами транслокаций являются ошибки молекулярно-генетических процессов рекомбинации и деления генетического материала. Межхромосомные перестройки-транслокации связаны с перемещением оторвавшегося участка хромосомы на другое место негомологичной хромосомы (хромосомы из другой пары). Участок хромосомы, отделившийся при разрыве, может быть утрачен клеткой при очередном митозе, если он не имел центромеры. Но чаще такой фрагмент прикрепляется к одной из хромосом. Различают несколько видов транслокаций: а) реципрокные — взаимный обмен участками между негомологичными хромосомами, б) нереципрокные (транспозиции) — присоединение фрагмента к своей же хромосоме в другом месте, в) полицентрические и др.

Хромосомные перестройки приводят к изменению морфологии хромосом, что заметно даже в световой микроскоп. При этом метацентрические хромосомы могут превращаться в субметацентрические, акроцентрические, и наоборот. Могут появиться кольцевые и полицентрические хромосомы.

Структурные перестройки хромосом половых клеток изменяют генетический баланс и генетические программы развития и функционирования эмбриона. Изменяется характер взаимодействия генов и их функционирования. Это отрицательно сказывается на структуре и функции клеток, органов и приводит к серьезными последствиями. Зачастую мутации оказываются несовместимыми с развитием нового организма или обусловливают появление патологий. Однако некоторые перестройки хромосом могут быть полезными для эволюции. Например, у человека 23 пары хромосом, а у современной человекообразной обезьяны 24 пары. Предполагается, что существенным этапом эволюции человека является робертсоновская транслокация — слияние 12 и 13 хромосомы обезьян, и образование второй хромосомы человека, которая почти полностью соответствует по генетическому составу своим предшественникам. В результате этого произошло изменение числа пар хромосом и комбинаций генов, что, вероятно, явилось одной из причин появления человека. Остальные хромосомы человека практически сходны с хромосомами шимпанзе, хотя есть некоторые отличия, например, перицентрические инверсии 4, 5, 12, 17 хромосом.

Хромосомные аберрации обнаруживаются цитогенетическим методом под световым микроскопом. У человека известна транслокационная форма болезни Дауна, когда часть 21 хромосомы во время мейоза присоединяется к 15-й и вместе с ней через гаметы попадает в зиготу,где появляются три 21 хромосомы. Крупные хромосомные аберрации в зиготах приводят к тяжелым аномалиям, несовместимым с жизнью или гибели зародышей на начальных стадиях эмбриогенеза.

Современные методы изучения кариотипа человека. Хромосомный комплекс вида со всеми его особенностями: числом хромосом, их формой, наличием видимых в световой микроскоп деталей строения, генным и аллельным составом называется кариотипом. Специфичность набора хромосом для каждого вида. Все живые организмы имеют постоянное число специфических хромосом в каждой соматической клетке. Диплоидное число хромосом (2п) для человека — 46, для дрозофилы — 8, для лошади — 66, шимпанзе — 48, собаки — 78 и т. д. Гаплоидное число (п) для человека — 23, дрозофилы — 4 и т. д. Гаметы обычно содержат только один набор хромосом.

Число хромосом в кариотипе индивидуума не зависит от высоты организации вида и не указывает на филогенетическое родство, т. к. одно и то же количество хромосом может встречаться у очень далеких друг от друга видов. Особенность проявляется в том, что каждый вид организмов имеет специфичный набор хромосом определенной формы и размеров. А главное, хромосомы организмов разных видов имеют свой Уникальный набор генов, определяющих развитие индивидуумов только определенно вида.

Микроскопические методы изучения хромосом человека применяются с конца XIX века. Соединение цитологического наблюдения хромосом с генетическим анализом сегрегации и сцепления генов привело к рождению цитогенетики. Термин «цитогенетика» введён В. Саттоном в 1903 г. Первоначально цитогенетика концентрировалась на проблемах корреляции генетических и цитологических (хромосомных) признаков. В последующем цитогенетика методически отделилась от генетики, и под термином «цитогенетика» понимают область науки, изучающей структуру и функции хромосом.

Цитогенетические методы предназначены для изучения структуры хромосомного набора или отдельных хромосом. Наиболее распространённым методом в цитогенетике человека является световая микроскопия. Электронная и конфокальная лазерная микроскопия применяется в современной цитогенетике только с исследовательскими целями. Во всей медико-генетической практике применяется световая микроскопия (главным образом в проходящем свете), включая люминесцентную микроскопию.

Объектом цитогенетических наблюдений могут быть делящиеся соматические, мейотические и интерфазные клетки. Каждый из этих объектов имеет преимущества и недостатки. Выбор объекта определяется целью исследования. Большинство цитогенетических исследований выполняется на соматических клетках.

Получение препаратов митотических хромосом. Первое главное условие цитогенетической диагностики — наличие делящихся клеток в цитологическом препарате.

Костный мозг, ткани семенника и хорион имеют достаточный митотический индекс для того, чтобы использовать эти объекты для цитогенетических целей. Однако, как показал опыт, несравненно информативнее исследование на культурах клеток: клетки освобождены от элементов соединительной ткани и хорошо суспендируются. Митотический индекс в культуре клеток намного выше, чем в тканях организма.

Культуры клеток можно получать из кусочков кожи (растут фибробласты), костного мозга, эмбриональных тканей, хориона, клеток амниотической жидкости. Наиболее удобным объектом для медицинских генетиков оказалась культура лимфоцитов периферической крови. Для её получения достаточно взять 1—2 мл венозной крови и добавить её в смесь питательной среды с фитогемагглютинином (белок бобовых растений). Последний вызывает иммунологическую трансформацию лимфоцитов и их деление. Продолжительность культивирования составляет 48-72 ч.

Вторым методическим условием цитогенетических исследований является использование колцемида (или колхицина), разрушающего веретено деления и останавливающего клеточное деление на стадии метафазы. Митотический индекс в культуре клеток за 2—3 ч повышается в 2—3 раза. Даже без культивирования экспозиция с колцемидом увеличивает число метафаз. Хромосомы в присутствии колцемида укорачиваются за счёт продолжающейся конденсации и, следовательно, в препарате они легче отделяются одна от другой. В тех случаях, когда необходим детальный анализ определённого района хромосомы, сильно конденсированные хромосомы на стадии метафазы (метод называется метафазным) непригодны для анализа. Для этих целей клетка должна быть зафиксирована на стадии, предшествующей метафазе, когда хромосома редуплицировалась, но ещё не полностью конденсировалась. Эта стадия — стадия прометафазы. Хотя хромосомы на данной стадии плохо разъединены (они ещё очень длинные) и на препарате имеется много наложений одной хромосомы на другую, все же в отдельных клетках можно найти участок, необходимый для анализа. Этот метод (или подход) в отличие от метафазного метода называют прометафазным или методом высокоразрешающей цитогенетики. Суть методического вмешательства при данной модификации метода состоит в прекращении процесса спирализации и конденсации хромосом в профазе с помощью препаратов, которые вводят в культуру клеток за несколько часов до фиксации.

Дифференциальное окрашивание хромосом.Метод простой окраски хромосом как единственный метод изучения кариотипа человека применялся до начала 70-х годов. В 70-х годах в практику вошли методы дифференциального окрашивания и хронологии репликации ДНК в хромосомах.

Дифференциальное окрашивание обеспечивается сравнительно простыми температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования эу- и гетерохроматических районов (тёмные и светлые полосы). Протяжённость этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района. Как видно из рис. 37.б, при дифференциальной окраске идентифицируются все хромосомы, плечи и даже определённые районы. Каждая хромосома имеет свой рисунок исчерченности. При дифференциальной окраске метафазных хромосом в кариотипе можно оценить около 200-400 участков. Такова разрешающая возможность метода.

 

 

 

 

Рис.37. Кариотипы при простой (а) и дифференциальной (б) окраске

 

 

Первоначально при специальном окрашивании хромосом использовали флюоресцентное алкилирующее вещество акрихин-иприт. Этот вариант был назван Q-методом. Данный метод требует быстрой обработки препарата, что не всегда удобно. Для просмотра препарата надо пользоваться люминесцентным микроскопом.

В последующем была разработана методика дифференциальной окраски без флюоресцентных красителей. Наиболее широко используется G-окраска (Гимза). При этом хромосомы предварительно обрабатывают (либо инкубация в солевом растворе, либо обработка протеазой). Предварительная обработка частично нарушает структуру хромосом, которая в некоторых участках восстанавливается при окраске, что и придаёт хромосоме индивидуальную исчерченность, или полосатость. Механизм образования сегментов пока недостаточно ясен. Предполагается, что окрашенные сегменты — гетерохроматиновые, поздно реплицирующиеся участки хромосом с повторяющимися последовательностями ДНК, а неокрашенные — эухроматиновые участки, в которых расположены кодирующие последовательности.

Для идентификации хромосом, помимо методов выявления линейной структурной дифференцированности, можно воспользоваться одной из важных характеристик хромосом человека – асинхронностью их репликации по длине (рис.38).

«Рисунки» последовательности репликации (рано или поздно реплицирующиеся участки) специфичны для каждой хромосомы. Для выявления

 

 
 

 


Рис.38. Метафазная пластинка с дифференциальной окраской сестринских хроматид

 

последовательности репликации применяется аналог тимидина 5-бромде-зоксиуридин. Участки хромосомы, включившие этот аналог, окрашиваются плохо. Используя этот метод, можно идентифицировать любую хромосому или хромосомную перестройку. Введение аналога 5-бромдезоксиуридина в культуру на 24 ч и более применяется для дифференциальной окраски сестринских хроматид. Если 5-бромдезоксиуридин ввести на полный клеточный цикл, то вновь образуемая хроматида включит аналог тимидина и будет окрашиваться слабо. Другая хроматида (старая) окрашивается, как обычно, интенсивно (рис.38.). Этот метод позволяет легко выявлять обмены между сестринскими хроматидами (СХО), число которых увеличивается при наследственных болезнях с хромосомной нестабильностью (анемия Фанкони, пигментная ксеродерма и др.). Число СХО увеличивается также при мутагенных воздействиях, поэтому метод учёта СХО широко используется при изучении мутационного процесса у человека.

Молекулярно-цитогенетические методы. Благодаря успехам молекулярной генетики человека разработан принципиально новый метод изучения хромосом — метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH). Принцип этого метода состоит в следующем (схема):

Для изучаемой хромосомы или конкретного её участка, исходя из специфичности последовательности оснований ДНК, готовят однонитевой участок ДНК, к которому присоединяется биотин или дигоксигенин. Такой «помеченный» участок ДНК называется зондом.

На микроскопическом препарате in situ при щелочной обработке хромосомная ДНК денатурируется, т.е. разрываются связи между двумя нитями ДНК.

Зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК-зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.

После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединиться к биотину или дигоксигенину. Как видно на схеме, для биотина таким веществом является стрептовидин, для дигоксигенина — антидигоксигениновое антитело. К этим веществам могут быть присоединены в один или два этапа флюоресцентные красители (родамин — красный цвет или флюоресцеин изотиоцианат — зелёный цвет).

С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных.

На схеме рассмотрена двойная гибридизация. Современные методические возможности позволяют увеличить число цветов.

Границы применения метода FISH очень широкие: от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами. Следует подчеркнуть, что соединение молекулярно-генетических и цитологических методов делает почти неограниченными возможности диагностики хромосомных аномалий, как очень сложных, так и очень мелких по размерам.

 

 

Рис.39. Схема двойной специфической флюоресцентной гибридизации in situ

 

Дву- и трёхцветная флюоресцентная гибридизация in situ применяется для учёта симметричных хромосомных аберраций у лиц, облученных много лет назад ионизирующими излучениями. Указанный метод требует меньше времени, чем кариотипирование дифференциально окрашенных метафаз (рис.39.).

В клинической цитогенетике метод FISH занимает всё большее место. В случаях сложных хромосомных перестроек, захватывающих более двух хромосом, дифференциальная G-окраска не всегда позволяет идентифицировать изменённые сегменты хромосом. В этих случаях применяют трёхцветный вариант метода FISH. Например, у ребёнка с множественными врождёнными аномалиями при G-анализе обнаружены сложные перестройки в 6 хромосомах (1,4. 7, 8, 9 и 12) с 10 разрывами. Полная идентификация разрывов возможна только с помощью FISH-окраски.

Метод FISH может применяться для диагностики анеуплоидий в интерфазных ядрах. Принцип метода в этом варианте такой же, как и для метафазных пластинок (описан выше). Например, специфичный для хромосомы 21 зонд ДНК, соединённый с биотином, гибридизируется с денатурированными клетками из амниотической жидкости на предметном стекле. В норме, т.е. если у плода есть дисомия по хромосоме 21, в ядре будут видны две флюоресцирующие соответствующим цветом точки. Если у плода трисомия, то в ядре будут видны 3 точки. Такой методический приём называют интерфазной цитогенетикой. Метод прост, экономичен и требует мало времени (несколько часов).

Метод сравнительной геномной гибридизации (CGH— comparative genome hybridization). Область использования метода — онкологическая цитогенетика. Назначение метода — определение районов хромосом, которые делегируются или амплифицируются в определённом типе опухоли. Районы делеций, как правило, содержат гены-супрессоры опухолевого роста, а районы амплификации содержат онкогены. Таким образом, метод используется в большей степени для картирования и клонирования генов, вовлечённых в канцерогенез.

Иногда бывает достаточно сложно получить хромосомные препараты хорошего качества из солидной опухоли или у больных с гематологическими онкозаболеваниями, поэтому был разработан оригинальный метод косвенного анализа хромосом в опухоли. Суть метода CGH в том, что из опухоли выделяют ДНК и метят её определённым флюорохромом. ДНК, выделенную из нормальной ткани, метят другим флюорохромом. Хромосомные препараты готовят стандартным способом из лимфоцитов периферической крови контрольного индивида. Меченую ДНК из опухоли и неизменённой ткани гибридизируют с хромосомным препаратом. По интенсивности свечения метки определяют области делеций и амплификации. Область разрешения —5—10 млн пар нуклеотидов. Для обработки данных используют программы компьютерного анализа хромосом.

Спектроскопический анализ хромосом (SKY). Этот метод использует флюоресцентные красители, имеющие сродство к определённым участкам хромосом. При использовании набора специфических зондов с разными красителями каждая пара хромосом имеет свои уникальные спектральные характеристики. Особенность метода — использование интерферометра, аналогичного используемым для измерения спектра астрономических объектов. Незначительные вариации в спектральном составе, неразличимые человеческим глазом, учитываются при компьютерной обработке, и затем программа назначает каждой паре хромосом легко распознаваемые цвета. Результат в виде цветного изображения чаще используется в цифровой форме. Анализ кариотипа значительно облегчается, поскольку гомологичные хромосомы имеют один и тоже цвет, а аберрации становятся легко различимыми. Кроме того, спектральное кариотипирование используется для выявления транслокаций, не распознаваемых традиционными методами. Область использования метода — онкоцитогенетика. Благодаря такому подходу удаётся точно описать множественные структурные перестройки хромосом, происходящие в опухолевых клетках. В клинической цитогенетике удаётся определять очень незначительные по величине транслокации, инсерции и маленькие маркерные хромосомы. Однако использование метода ограничено высокой стоимостью оборудования для анализа.

Показания для цитогенетического исследования достаточно широкие, особенно при акушерско-гинекологической и детской патологии. Ниже приводится перечень (возможно, неполный) состояний, при которых с диагностическими целями надо иметь результаты цитогенетического исследования, проведённого у пациента (пробанда) и при необходимости у его родственников.

Подозрение на хромосомную болезнь по клинической симптоматике (для подтверждения диагноза).

Наличие у ребёнка множественных врождённых пороков развития, не относящихся к генному синдрому.

Многократные (более двух) спонтанные аборты, мертворождения или рождения детей с врождёнными пороками развития.

Нарушение репродуктивной функции неясного генеза у женщин и мужчин (первичная аменорея, бесплодный брак и др.).

Существенная задержка умственного и физического развития у ребенка.

Пренатальная диагностика (по возрасту, в связи с наличием транслокации у родителей, при рождении предыдущего ребёнка с хромосомной болезнью).

Подозрение на синдромы, характеризующиеся хромосомной нестабильностью (учёт хромосомных аберраций и СХО).

Лейкозы (для дифференциальной диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза течения).

Оценка мутагенных воздействий (радиационных, химических). Медицинских ограничений для применения цитогенетических методов нет.

Однако необходимо помнить, что эти методы трудоёмкие, дорогие, назначение их наугад неоправданно (по принципу «если неясно, то давайте назначим»). Правильнее назначать цитогенетическое исследование по рекомендации врача-генетика после проведения медико-генетического консультирования. Опыт работы зарубежных медицинских учреждений показал необходимость создания цитогенетических лабораторий при больших многопрофильных больницах и медико-генетических консультациях, комплексно обслуживающих какой-либо район или город. В Украине цитогенетические исследования проводятся в медико-генетических кабинетах и медико-генетических консультациях.

Класссификация мутаций по причине возникновения. В зависимости от причин возникновения мутации могут быть спонтанные или индуцированные. Спонтанные — это мутации, которые происходят в природе внезапно без видимых причин под действием каких-то факторов. Индуцированные — это мутации, происходящие при направленном воздействии определенных мутагенов.

До 1925—1927 гг. генетики имели дело только со спонтанными мутациями. Различные попытки повысить частоту мутаций, в том числе и предпринятые Т. X. Морганом, не приносили успеха. Создавалось впечатление, что мутационный процесс не зависит от окружающей среды. Это стимулировало автогенетические концепции, согласно которым эволюцию организмов связывали только с действием внутренних факторов.

Овладение методами индуцированного мутагенеза сыграло огромную роль в борьбе с такими тенденциями, а также расширило возможности генетического анализа. Впервые повышение частоты наследственной изменчивости под влиянием внешних агентов обнаружили в 1925 г. советские микробиологи Г. А. Надсон и Г. С. Филиппов. Они наблюдали увеличение разнообразия наследственных форм — сальтантов, как они их назвали, после воздействия «лучами радия» на низшие грибы.

В 1927 г. Г. Мёллер сообщил о действии рентгеновых лучей на мутационный процесс у дрозофилы и предложил ставший классическим количественный метод учета рецессивных летальных мутаций в Х-хромосоме у этого объекта. Почти одновременно Л. Стадлер (1928) описал влияние рентгеновых лучей на мутационный процесс у ячменя. В том же году М. Н. Мейсель в лаборатории Г. А. Надсона получил мутации у дрожжей под действием химических соединений (хлороформ и др.).

В 30-х годах открыт химический мутагенез у дрозофилы: сначала В. В. Сахаров (1932), а затем М. Е. Лобашев и Ф. А. Смирнов (1934) показали, что некоторые соединения (йод, уксусная кислота, аммиак) способны индуцировать рецессивные летали в Х-хромосоме. В 1939 г. С. М. Гершензон открыл сильный мутагенный эффект экзогенной ДНК у дрозофилы. Мощные химические мутагены были открыты в 1946 г. И. А. Рапопортом (этиленимин) в СССР и Ш. Ауэрбах и Дж. Робсоном (азотистый иприт) в Англии.

С тех пор в арсенал мутагенных факторов вошли разнообразные химические соединения: аналоги оснований, включающиеся непосредственно в ДНК, такие агенты, как азотистая кислота или гидроксиламин, модифицирующие основания, соединения, алкилирующие ДНК (этилмегансульфонат, метилметансульфонат и др.), соединения, интеркалирующие между основаниями ДНК (акрихины и их производные), и многие другие. Наряду с мутагенами были найдены вещества-антимутагены.

Возможность изменять скорость мутационного процесса послужила решающим стимулом к выяснению причин спонтанных мутаций. Одна из первых попыток объяснить причины спонтанных мутаций сводилась к предположению о том, что в действительности их индуцирует естественный фон радиоактивности. Однако выяснилось, что таким путем можно объяснить возникновение лишь около 0,1 % всех спонтанных мутаций у дрозофилы. Не подтвердилась и гипотеза о тепловом движении атомов как главной причине спонтанных мутаций. Были попытки объяснить спонтанные мутации результатом действия продуктов метаболизма клетки и организма.

Современная точка зрения на причины спонтанных мутаций сформировалась в 60-х годах благодаря выяснению механизмов воспроизведения, репарации и рекомбинации генов и открытию ферментных систем, ответственных за эти процессы. Возникла тенденция объяснять генные мутации как ошибки в работе ферментов матричного синтеза ДНК. Сейчас эта гипотеза общепризнана. Притягательность гипотезы заключается также в том, что она позволяет рассматривать и индуцированный мутационный процесс как результат вмешательства внешних факторов в нормальное воспроизведение носителей генетической информации, т. е. дает единое объяснение причин спонтанных и индуцированных мутаций. Большое влияние на развитие теории мутационного процесса оказало изучение его генетического контроля. Были открыты гены, мутации которых могут повышать или понижать частоту как спонтанных, так и индуцированных мутаций. Эти и другие факты, убедительные аргументы в пользу существования общих причин индуцированного и спонтанного мутационного процесса.

Первое объяснение механизма мутационных изменений (генных мутаций и хромосомных аберраций) было предложено в 1935 г. Н. В. Тимофеевым-Ресовским, К. Циммером и М. Дельбрюком на основании анализа радиационного мутагенеза у высших организмов и прежде всего у дрозофилы. Мутация рассматривалась как результат мгновенной перестройки атомов в сложной молекуле гена. Причиной такой перестройки считалось непосредственное попадание в ген кванта или ионизирующей частицы или же случайные колебания атомов.

Открытие в дальнейшем эффекта последействия ионизирующих излучений показало, что мутации возникают в результате процесса, длящегося во времени, а не непосредственно в момент прохождения кванта энергии или ионизирующей частицы через ген.

Перспективы преодоления этих и других противоречий зарождающейся теории мутационного процесса были намечены в физиологической гипотезе мутационного процесса, высказанной 1946 г. М. Е. Лобашевым.

Сущность гипотезы М. Е. Лобашева заключалась в том, что «благодаря способности клетки репарировать полученные повреждения становление мутации должно осуществляться в процессе обратимости повреждения, т. е. в процессе восстановления (репарации)». Это означало, что появлению мутации должно предшествовать предмутационное состояние или потенциальное изменение, которое может быть устранено (тождественная репарация) либо реализуется в виде мутации (нетождественная репарация). Для доказательства существования таких предмутационных состояний М. Е. Лобашев, его ученики К. В. Ватти, М. М. Тихомирова и другие в опытах с дрозофилой, облученной рентгеновыми лучами, дополнительно воздействовали на нее высокой температурой, которая сама по себе мутаций практически не вызывала. Мухи, подвергнутые такому комбинированному воздействию, обнаруживали более высокую мутабильность, чем после воздействия только рентгеновыми лучами.

Несмотря на то, что физиологическая гипотеза мутационного процесса была сформулирована на основе общепринятых в то время представлений о белках как носителях генетической информации, она оказалась справедливой и в отношении молекул ДНК. Действительно, многие повреждающие агенты приводят к локальной денатурации молекул ДНК, а устранение этих нарушений структуры (репарация) — к возникновению мутаций. Связь мутаций с процессами репарации в настоящее время доказана практически для всех исследованных объектов. Ныне физиологическая теория выросла из рамок гипотезы, символизируя современный период в изучении мутационного процесса.

Мутагенные факторы. Загрязнение окружающей среды опасно не только ныне живущему поколению, но часто представляет опасность для грядущих поколений, поскольку многие загрязнители мутагенны (или, что почти то же самое, генетически активны). Выявление и устранение генетически активных факторов из среды обитания человека — задача генетической токсикологии, которая представляет собой наиболее активно развивающийся раздел экологической генетики. Это объясняется ее огромным прикладным значением.

Парадоксально, но факт, что открытие индуцированного мутационного процесса потребовало значительных усилий от исследователей: вспомним, что Г.Дж. Меллер получил Нобелевскую премию за открытие мутагенного действия рентгеновых лучей (1927 год). Теперь же мутагены обнаруживаются на каждом шагу. Многие продукты производственной деятельности человека, появляющиеся как результат так называемого технического прогресса, обладают генетической активностью. При этом мы говорим не только об отходах производства. Это могут быть лекарства, консерванты, пищевые добавки и красители, косметика, инсектициды и пестициды, не говоря уже о дыме сигарет и излучениях, сопровождающих «мирный атом», тем более оружие массового уничтожения — ядерное и химическое. Сложнее обстоит дело с новыми, как правило антропогенными, факторами внешней среды, которые никогда не встречались в природе в ходе биологической эволюции. Так, например, многие инсектициды — хлорированные углеводороды никогда не существовали в природе. Они не трансформируются в пищевых цепях и потому неразложимы биологическим путем, что не учитывалось при их применении. К ним относятся полихлорбифенилы, в частности пестициды: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д) или 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (2,4,5-Т) — эффективные дефолианты. Притчей во языцех становятся в последнее время диоксины, также относящиеся к полихлорированным бифенилам и представляющие собой самые активные яды, известные в настоящее время. Один из них входил в состав печально известного agent orange, применявшегося армией США во Вьетнаме в качестве боевого дефолианта. Диоксины образуются также при сжигании мусора в больших количествах на заводах по уничтожению городских отходов.

В списке наиболее значимых антропогенных факторов загрязнения среды (из 19 наименований) первые пять мест занимают: 1) пестициды; 2) тяжелые металлы; 3) диоксид углерода; 4) диоксид серы и продукты ее окисления, взвеси; 5) разливы нефти, сточные воды промышленных предприятий. При этом радиоактивные отходы, обладающие несомненной генетической активностью, стоят только на 12-м месте как загрязнители.

В генетической токсикологии принято говорить не только о мутагенах, но и, более широко, о генетически активных факторах. Не всегда удается определить непосредственно мутагенный эффект того или иного воздействия, но можно показать его влияние на кроссинговер, то есть на рекомбинацию генов или индукцию репаративного синтеза ДНК, сопровождающего многие повреждения генетического материала.

Таким образом, мутагенез, рекомбинагенез и индукция репаративного синтеза ДНК — это показатели генотоксичности или генетической активности исследуемого фактора.

Генетически активные факторы делятся на физические, химические и биологические. К физическим факторам относятся температура, ионизирующая радиация, ультрафиолетовый свет, по-видимому, высокочастотное электромагнитное излучение, ультразвук и т.д. Химические генетически активные факторы гораздо труднее поддаются перечислению и классификации. Достаточно сказать, что к ним относятся любые вещества, прямо или косвенно нарушающие структуру и воспроизведение молекул ДНК. Выхлопные газы автотранспорта и выбросы в атмосферу производственных предприятий содержат алкилирующие соединения (их называют радиомиметиками), органические соединения ртути, полициклические углеводороды, обладающие генетической активностью. Многие химические соединения сами по себе не проявляют генетической активности, но их легко активируют внутриклеточные метаболиты, а иногда и соединения, находящиеся в окружающей организм среде. Например, распространенные соли азотной кислоты легко превращаются в нитриты (соли азотистой кислоты) — мутагены, дезаминирующие основания ДНК. В кислой среде желудка млекопитающих нитриты и аминосо-единения дают нитрозосоединения — супермутагены, нарушающие репликацию ДНК. Многие вещества, так называемые промутагены, активируются в организме млекопитающих при действии цитохрома P-450. Этот фермент, синтезируемый в печени, относится к классу неспецифических монооксигеназ и предназначен для инактивации чужеродных соединений, попадающих в организм. Но Р-450 вместе с тем способен активировать некоторые промутагены. Более того, он может активировать не только промутагены, но и потенциальные канцерогены — вещества, вызывающие рак. Необходимо отметить высокий уровень корреляции между мутагенным и канцерогенным эффектами многих факторов, прежде всего физических и химических.

Особый интерес представляют биологические генетически активные факторы. В конце 30-х годов С.М. Гершензон установил мутагенный эффект ДНК и вирусов. Позже было выяснено, что хромосомные аберрации в соматических клетках вызывают вирусы оспы, кори, ветряной оспы, гриппа, гепатита. Стрептолизин-О, токсин гемолитического стрептококка, повышает частоту мутаций в культуре эмбриональных фибробластов человека. В контроле частота хромосомных аберраций составляет 4,0 ± 0,5%, а при действии токсина - 24,3 ± 0,6%. Ю.Я. Керкис показал мутагенный эффект иммунологического стресса при пересадке и отторжении в силу тканевой несовместимости кожного лоскута у мышей. Мощным мутагеном биологического происхождения оказался афлатоксин — продукт жизнедеятельности плесневого гриба Aspergillusflavus.

Под руководством М.Е. Лобашева еще в 60-е годы на кафедре генетики и селекции Ленинградского университета были начаты эксперименты, доказавшие роль нервной системы в контроле частоты хромосомных аберраций в соматических клетках (роговице глаза) у мышей. Развивая это направление, ученики М.Е. Лобашева (Р.И. Цапыгина, С.Н. Новоков, Е.В. Даев) показали мутагенный эффект феромонального стресса у мышей. При этом важно, что речь идет уже о мутациях не в соматических, а в генеративных клетках — при сперматогенезе. Схема проделанного эксперимента представлена на рис. 40.

 

 

 

Рис.40. Влияние феромонального стресса на частоту хромосомных аберраций у мышей. Гистограмма показывает частоту аберраций в сперматогенезе: 1 - без дополнительного воздействия; 2 - результат помещения мышей 30-дневного возраста на чистую подстилку; 3,4- результат помещения мышей того же возраста на подстилку после пребывания на ней самцов 3-4-месячного возраста.

 

Известно, что запах во взаимоотношениях мышей выполняет функции своеобразного языка. Феромоны, летучие вещества, содержащиеся в моче этих животных, играют роль сигналов, вызывающих реакцию подчинения, агрессии и т.д. Пользуясь этими сигналами, старые самцы держат в подчинении самок и молодых самцов. Оказалось, что запах взрослого самца при однократном воздействии повышает частоту цитологических нарушений в сперматогенезе у молодых самцов, увеличивает частоту аномальных сперматозоидов и доминантных летальных мутаций, выявляемых после их спаривания с самками, не подвергавшимися воздействию.

Методы определения мутагенной активности веществ. С некоторых пор (у нас с 1979 года) все новые химические соединения (а всего их в обиходе более 4,5 млн) проходят проверку на генетическую активность. Это своеобразная служба генетической безопасности, использующая богатый арсенал различных тест-систем для выявления генетической активности. Эти системы позволяют учитывать мутации генов, их рекомбинации, потери и другие аберрации хромосом, нарушения делений ядра, индукцию репарации ДНК и т.д. При этом используются различные объекты: бактерии, дрожжи и другие низшие грибы, плодовая мушка-дрозофила, растения, культура клеток животных и человека.

Наибольший интерес представляет генетическая активность исследуемых агентов для человека. Поскольку прямое исследование их действия на человека невозможно, приходится ограничиваться результатами, получаемыми на модельных объектах. Эти результаты в значительной степени справедливы и для человека из-за биологической универсальности свойств генетического материала — это всегда ДНК. Тем не менее экстраполяция получаемых результатов на человека всегда представляет некоторые сложности, так как наряду с принципом биологической универсальности следует учитывать и специфику объектов, имеющих свои особенности реагирования на мутагены.

В качестве примера рассмотрим только одну тест-систему, получившую широкое распространение при первичном выявлении генетической активности. Это система, разработанная в 60-е годы XX века американским исследователем Б. Эймсом, который длительное время изучал мутации в генах, контролирующих биосинтез гистидина у Salmonella typhimuium. Работа Б. Эймса, прекрасный пример того, как первоначально чисто теоретическое исследование, направленное на выяснение структуры и функции гена, приобрела сугубо практическое значение. Имея в своем распоряжении подробно охарактеризованные мутанты сальмонеллы, нуждающиеся в гистидине, зная молекулярную природу мутационных изменений: замены, вставки или выпадения пар оснований в ДНК гена или более крупные перестройки генетического материала, Эймс предложил изучать реверсии гистидиновых мутантов, то есть восстановление у них способности синтезировать гистидин, и, следовательно расти на среде без гистидина в результате воздействия различных мутагенов.

Тест очень прост: достаточно засеять среду без гистидина мутантом сальмонеллы, нуждающимся в гистидине (который естественно не растет на такой среде), и нанести в центр используемой для этого чашки Петри испытуемое химическое соединение. Через 2—3-е суток можно видеть появление колоний мутантов (в данном случае ревертантов) вокруг пятна нанесенного вещества, если оно обладает генетической активностью (рис.41.). Это пример так называемого спот-теста (от англ. spot — пятно). В настоящее время тест Эймса усовершенствован: наряду с хорошо изученными мутациями потребности в гистидине в геном сальмонеллы вводят делецию по одному из генов репарации, то есть инактивируют этот процесс, тем самым повышают чувствительность бактерии к мутагенам. Вводят также мутацию, блокирующую синтез липополисахаридной капсулы для повышения проницаемости клеток, а также плазмиды, повышающие чувствительность клеток к агентам, усиливающим рекомбинацию. Наконец, испытуемое вещество стали наносить вместе с экстрактом мышиной или крысиной печени, содержащим цитохром Р450 для акт


Поделиться:

Дата добавления: 2015-09-14; просмотров: 319; Мы поможем в написании вашей работы!; Нарушение авторских прав





lektsii.com - Лекции.Ком - 2014-2024 год. (0.006 сек.) Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав
Главная страница Случайная страница Контакты