Регуляция клеточного цикла. Апоптоз. Онкогенетика. 2 страница

а) Деградация β-катенина производится с помощью убиквитинзависимого механизма. Причем в каче­стве убиквитинлигазы (фермента, переносящего убиквитин на Р-катенин) выступает уже знакомый нам фактор АРС, обеспечивающий анафазу.

Последний выполняет такую же функцию в отношении циклинов, необходимых для вхождения клетки в цикл. Поэтому нет ничего удивительного, что одновременно с данными циклинами разрушается и транскрипционный фактор, требую­щийся для их синтеза. Происходит же это в метафазе и анафазе митоза, когда АРС активируется путем фосфорилирования.

По некоторым данным, перед взаимодействием с АРС β-ка­тенин тоже должен подвергнуться фосфорилированию — киназой-ЗР-гликогенсинтетазы (GSK-3P), которая, в свою очередь, находится под контролем ряда белков.

Такое «повышенное внимание» со стороны клетки к β-катенину — косвенное свидетельство его ключевой роли в запуске деления. Это вполне согласуется с предположением, что β-кате­нин — необходимый компонент универсального транскрип­ционного комплекса, начинающего клеточный цикл при любом митогенном стимуле.

б) Второй факт состоит в том, что при контактном торможе­нии в клетке увеличивается содержание белка р53. Это тоже выглядит вполне естественно, если считать, что все тот же комплекс транскрипционных факторов, помимо про­чего, ускоряет распад белка р53, выключая ген белка ARF — инги­битора протеолиза белка р53.

Конечно, известно здесь еще далеко не все. Но о принципе работы и некоторых деталях этого замечательного механизма уже можно сказать.

Что касается принципа работы, то он достаточно прост и очевиден. Комплекс циклин-Cdk очередной стадии цикла, как правило, должен обеспечить три процесса:

а) «выведение из игры» комплекса предыдущей стадии,

б) стимуляцию событий «своей» стадии,

в) образование (или активацию) комплекса следующей стадии.

Получается своего рода «цепной» механизм, после включения, которого каждая стадия процесса подготавливает усло­вия для перехода к следующей стадии. Несомненно, таков же принцип многих других сложных биологических процессов — таких, как эмбриональное развитие, дифференцировка, реге­нерация.

Посмотрим теперь, как конкретно реализуется этот прин­цип в случае клеточного цикла.

Контрольные точки митотического цикла. (Белок р53, микротрубочки: связь с клиникой). Точная репликация и распределение генетиче­ского материала — это важнейшие условия выжива­ния клетки. В клеточном цикле существуют четыре точки, в которых точность репликации, правиль­ность последовательности и равное разделение ДНК контролируются специальными клеточными механизмами.

A. Контрольная точка фазы G₁. Если в фазе G₁ обнаруживается повреждение ДНК, белок р53 выступает в роли фактора транскрипции и вызыва­ет задержку клеток в G₁. Нестабильный р53 обыч­но быстро разрушается. Однако, когда в клетке по­является аномальная ДНК, белок р53 стабилизи­руется и присоединяется к этой ДНК. В результате р53 накапливается в ядре и стимулирует экспрес­сию белка, ингибирующего Cdk2.

Клетка задерживается в фазе G₁ до тех пор, пока поврежденные нуклеотиды не будут восстановле­ны ферментами репарации. Задержка в фазе G₁ предотвращает копирование поврежденных осно­ваний и тормозит мутацию ДНК. При отщеплении белка р53 от ДНК его концентрация снижается; ингибитор Cdk отделяется, и Cdk начинает экспрессироваться.

В клетках многих метастатических опухолей че­ловека оба аллеля р53 неактивны. В таких клетках нарушен нормальный контроль, осуществляемый р53, и поврежденная ДНК может реплицироваться. В некоторых случаях это приводит к метастатичес­кой трансформации опухолей.

Б. Контрольная точка S-фазы функциони­рует в фазе S, когда реплицируется ДНК. Появле­ние мутаций в процессе репликации и их после­дующее встраивание в геном может вызвать серь­езные последствия, включая гибель клетки. Если произошли ошибки в репликации, (что случается) и если они были пропущены репаративными фер­ментами, клетка не может выйти из S-фазы. Про­верка точной репликации ДНК — важнейшая регуляторная точка клетки.

B. Контрольная точка С₂-фазы. Нереплицированная ДНК блокирует переход клетки от С₂ -фазы к М-фазе. Происходит катастрофическое повре­ждение, если клетка проходит через фазу цикла, незавершив молекулярные процессы, необходимые для подготовки к делению. Например, при введе­нии MPF в клетки, находящиеся в S-фазе, неполно­стью реплицированные хромосомы конденсируют­ся, а затем фрагментируются.

Г. Контрольная точка М-фазы. Причиной остановки цикла в данной точке может быть неправильная сборка веретена деления. Например, неприкрепление кинетохоры какой- либо хроматиды к микротрубочкам веретена деления. Микротрубочки (МКТ) постоянно полимеризуются и деполимеризуются. Во время митоза происходят резкие и непредсказуемые переходы МКТ из растущего (полимеризация) в сокращающееся (деполимеризация) состояние - это катастрофа и обратно – это спасение. Медикаментозная терапия онкологических больных заключается в разрушении митотического веретена колхицином, винбластином и винкристином, которые нарушают полимеризацию МКТ.

В зависимости от результатов «проверки», выбирается один из трех вариантов:

а) безостановочный переход к следующей стадии цикла;

б) задержка на текущей стадии для исправления обнаруженных дефектов;

в) запуск механизма апоптоза, если выявленные нарушения неисправимы.

В большинстве, если не во всех, случаях хромосомных повреждений центральную роль в остановке цикла играет белок р53.

Роль белка р53 («Страж генома», «Диспетчер апоптоза», Опухолевый супрессор). Белок р53 контролирует исключительно важные клеточные процессы и, благодаря этому, вовлечен в большое количество всевозможных регуляторных цепей. Он (или его ген) активируется в ответ на разнообразные повреждения клеточной структуры: нерепарированные разрывы и другие повреждения ДНК, нарушение расхождения хромосом в митозе, разрушение микротрубочек и т. д.

Сам же белок р53 регулирует активность, по крайней мере, трех групп генов:

1) активирует гены (Р21, GADD45 и другие), отвечающие за остановку клеточного деления;

2) активирует гены (BAX, KILLER/DR5, PIG и другие), запускающие апоптоз – процесс, ведущий, путем активации специальных ферментов, к гибели клетки; а так же репрессирует гены (BCL2, RELA), сдерживающие апоптоз;

3) активирует гены (TSP1, BAI1 и другие), тормозящие ангиогенез (образование новых сосудов).

В итоге через посредничество белка р53 клетка в ответ на повреждение своей структуры

- либо задерживается на той или иной стадии митотического цикла и исправляет эти повреждения;

- либо (при невозможности исправлений) вообще прекращает деления и вступает в процесс клеточного старения (фаза III по Хейфлику);

- либо (при потенциальной опасности поврежденной клетки для ее окружения) осуществляет апоптоз, т. е., попросту говоря, самоубийство.

В частности, апоптозу, помимо прочих, подвергаются и клетки, в которых произошла опухолевая трансформация. В этой связи понятно, почему одновременно тормозится ангиогенез: это еще один способ ограничения опухолевого роста.

Поэтому белок р53 – один из наиболее важных опухолевых супрессоров. В большинстве уже развивающихся опухолей функции белка р53 оказываются в том или ином отношении нарушены.

Такова общая биологическая роль белка р53, а теперь рассмотрим некоторые связанные с ним вопросы более детально.

Белок р53 состоит из 392 аминокислот, образующих 6 доменов (рис. 44):

1) N-концевой домен активирует ген белка р21 (ингибитор киназ), а так же других белков, останавливающих деление клетки.

2) дополнительный транскрипционный домен для активации генов-мишеней.

3) гибкий пролиновый домен проявляет супрессорную активность, запускает апоптоз.

4) центральный домен связывается с энхансерами. В этом участке мутации 5-8 экзонов приводят к онкогенезу.

5) α-спиральный домен отвечает за ядерную локализацию р53 и образование тетрамеров (мономеры не активны).

6) С-концевой домен – мишень для модифицирующих ферментов (киназ, ацетилаз, гликозилаз).

Рис.44. Белок р53

Если С-концевой домен не модифицирован, центральный домен не способен взаимодействовать с ДНК-мишенью. Модификация же С-домена не только придает белку р53 такую способность, но и влияет на его специфичность. Дело в том, что р53-зависимые энхансеры (относящиеся к разным генам) несколько различаются последовательностью нуклеотидных пар. И от вида модификации С-домена зависит, с какими конкретно энхансерами будет связываться белок р53, а с какими – нет.

Таким образом, с помощью модификации двух концевых ( N- и С-) доменов белок р53 получает (от очень многочисленных «источников») информацию о состоянии клетки, перерабатывает ее путем изменения своей конфигурации и надлежащим образом реагирует как транскрипционный фактор определенных генов.

С-концевой домен выполняет еще одну функцию. Как отмечалось выше, некоторые гены (BCL2, RELA) белком р53 не активируются, а репрессируются. Это действие, как считают, осуществляется С-доменом. При этом последний (вместо N-домена) связывается с комплексом TFIID и подавляет его активность.

Апоптоз (Программированная гибель клеток).В Англии в Кембриджском университете в начале 60х годов Сидней Бреннер изучал нематоду Сaenorzhabditis elegans – 1мм длиной, прозрачна (видно деление клеток). Сотрудник его лаборатории Джон Салстон описал схему развития из яйцеклетки взрослого червя. При развитии нематоды образуется 1090 клеток, из которых 131 клетка идет в апоптоз, остается 959 клеток. Гены смерти, приводящие клетки к апоптозу, установил американец Роберт Хорвиц. Впоследствии, благодаря этим работам, они стали лауреатами Нобелевской премии в области молекулярной биологии.

Термин «апоптоз» появился в науке в 1972г. I. Kerr заимствовал его у Гиппократа, в переводе с греческого «апоптоз» – осенний листопад.

Апоптоз - программированная клеточная гибель, энергетически зависимый, генетически контролируемый процесс, который запускается специфическими сигналами и избавляет организм от ослабленных, ненужных или повреждённых клеток. В организме здорового человека клеточный гомеостаз определяется балансом между гибелью и пролиферацией клеток. Ежедневно, примерно около 5% клеток организма подвергаются апоптозу, а их место занимают новые клетки. В процессе апоптоза клетка исчезает бесследно в течение 15-120 минут. Апоптоз – это биохимически специфический тип гибели клетки, который характеризуется активацией нелизосомных эндогенных эндонуклеаз, которые расщепляют ядерную ДНК на маленькие фрагменты. Морфологически апоптоз проявляется гибелью единичных, беспорядочно расположенных клеток, что сопровождается формированием округлых, окруженных мембраной телец (“апоптотические тельца”), которые тут же фагоцитируются окружающими клетками.

Это энергозависимый процесс, посредством которого удаляются нежелательные и дефектные клетки организма. Он играет большую роль в морфогенезе и является механизмом постоянного контроля размеров органов. При снижении апоптоза происходит накопление клеток, пример – опухолевый рост. При увеличении апоптоза наблюдается прогрессивное уменьшение количества клеток в ткани, пример – атрофия.

Назначение апоптоза в клеточных популяциях можно сформулировать таким образом:

· поддержание численности клеток в популяции на заданном уровне;

· определение этого уровня и его изменение под влиянием внешних (по отношению к клетке) сигналов вплоть до полной элиминации данного типа клеток;

· селекция разновидностей клеток внутри популяции (в том числе элиминация клеток с генетическими дефектами).

Морфологические проявления апоптоза. Апоптоз имеет свои отличительные морфологические признаки, как на светооптическом, так и на ультраструктурном уровне. При окраске гематоксилином и эозином апоптоз определяется в единичных клетках или небольших группах клеток. Апоптотические клетки выглядят как округлые или овальные скопления интенсивно эозинофильной цитоплазмы с плотными фрагментами ядерного хроматина. Поскольку сжатие клетки и формирование апоптотических телец происходит быстро и также быстро они фагоцитируются, распадаются или выбрасываются в просвет органа, то на гистологических препаратах он обнаруживается в случаях его значительной выраженности. К тому же апоптоз – в отличие от некроза – никогда не сопровождается воспалительной реакцией, что также затрудняет его гистологическое выявление.

Апоптоз – это механизм гибели клеток, который имеет ряд биохимических и морфологических отличий от некроза (рис.45). Наиболее четко морфологические признаки выявляются при электронной микроскопии.

Рис.45. Изменение ультраструктуры клеток животных при некрозе и апоптозе: 1 – нормальная клетка, 2 – апоптотическое сморщивание клетки с образованием пузырчатых выростов, 3 – фрагментация клетки с образованием апоптотических везикул, 4 – набухание клетки при некрозе, 5 – некротическая дезинтеграция клетки.

Для клетки, подвергающейся апоптозу, характерно ее сжатие и конденсация хроматина.

Сжатие клетки. Клетка уменьшается в размерах; цитоплазма уплотняется; органеллы, которые выглядят относительно нормальными, располагаются более компактно. Предполагается, что нарушение формы и объема клетки происходит в результате активации в апоптотических клетках трансглютаминазы. Этот фермент вызывает прогрессивное образование перекрестных связей в цитоплазматических белках, что приводит к формированию своеобразной оболочки под клеточной мембраной, подобно ороговевающим клеткам эпителия.

Конденсация хроматина. Это наиболее характерное проявление апоптоза. Хроматин конденсируется по периферии, под мембраной ядра, при этом образуются четко очерченные плотные массы различной формы и размеров. Ядро же может разрываться на два или несколько фрагментов. Механизм конденсации хроматина изучен достаточно хорошо. Он обусловлен расщеплением ядерной ДНК в местах, связывающих отдельные нуклеосомы, что приводит к развитию большого количества фрагментов, в которых число пар оснований делится на 180-200. При электрофорезе фрагменты дают характерную картину лестницы. Эта картина отличается от таковой при некрозе клеток, где длина фрагментов ДНК варьирует. Фрагментация ДНК в нуклеосомах происходит под действием кальций чувствительной эндонуклеазы. Эндонуклеаза в некоторых клетках находится постоянно (например, в тимоцитах), где она активируется появлением в цитоплазме свободного кальция, а в других клетках синтезируется перед началом апоптоза. Однако еще не установлено, каким образом после расщепления ДНК эндонуклеазой происходит конденсация хроматина. Формирование в цитоплазме полостей и апоптотических телец. В апоптотической клетке первоначально формируются глубокие впячивания поверхности с образованием полостей, что приводит к фрагментации клетки и формированию окруженных мембраной апоптотических телец, состоящих из цитоплазмы и плотно расположенных органелл, с или без фрагментов ядра.

Фагоцитоз апоптотических клеток или телец осуществляется окружающими здоровыми клетками, или паренхиматозными, или макрофагами. Апоптотические тельца быстро разрушаются в лизосомах, а окружающие клетки либо мигрируют, либо делятся, чтобы заполнить освободившееся после гибели клетки пространство.

Фагоцитоз апоптотических телец макрофагами или другими клетками активируется рецепторами на этих клетках: они захватывают и поглощают апоптотические клетки. Один из таких рецепторов на макрофагах – рецептор витронектина, который является β3-интегрином и активирует фагоцитоз апоптотических нейтрофилов.

Апоптоз принимает участие в следующих физиологических и патологических процессах:

· запрограммированном разрушении клеток во время эмбриогенеза (включая имплантацию, органогенез). Несмотря на то, что при эмбриогенезе апоптоз не всегда является отражением “запрограммированной смерти клетки”, это определение апоптоза широко используют различные исследователи,

· гормон-зависимой инволюции органов у взрослых, например, отторжение эндометрия во время менструального цикла, атрезии фолликулов в яичниках в менопаузе и регрессия молочной железы после прекращения лактации,

· удалении некоторых клеток при пролиферации клеточной популяции,

· гибели отдельных клеток в опухолях, в основном при ее регрессии, но также и в активно растущей опухоли,

· гибели клеток иммунной системы, как В-, так и Т-лимфоцитов, после истощения запасов цитокинов, а также гибели аутореактивных Т-клеток при развитии в тимусе,

· патологической атрофии гормон - зависимых органов, например, атрофии предстательной железы после кастрации и истощении лимфоцитов в тимусе при терапии глюкокортикоидами,

· патологической атрофии паренхиматозных органов после обтурации выводных протоков, что наблюдается в поджелудочной и слюнных железах, почках,

· гибели клеток, вызванных действием цитотоксических Т-клеток, например, при отторжении трансплантата и болезни “трансплантат против хозяина”,

· повреждении клеток при некоторых вирусных заболеваниях, например, при вирусном гепатите, когда фрагменты апоптотических клеток обнаруживаются в печени, как тельца Каунсильмана,

· гибели клеток при действии различных повреждающих факторов, которые способны вызвать некроз, но действующих в небольших дозах, например, при действии высокой температуры, ионизирующего излучения, противоопухолевых препаратов.

Молекулярные механизмы апоптоза.Апоптоз – многоэтапный процесс. Первый этап – прием сигнала, предвестника гибели в виде информации, поступающей к клетке извне или возникающей в недрах самой клетки. Сигнал воспринимается рецептором и подвергается анализу.

Далее через рецепторы или их сочетания полученный сигнал последовательно передается молекулам-посредникам (мессенджерам) различного порядка и в конечном итоге достигает ядра, где и происходит включение программы клеточного самоубийства путем активации летальных и/или репрессии антилетальных генов. Однако существование ПКС (программируемая клеточная смерть) в безъядерных системах (цитопластах – клетках, лишенных ядра) показывает, что наличие ядра не является обязательным для реализации процесса.

Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз – семейства эволюционно консервативных цистеиновых протеаз, которые специфически расщепляют белки после остатков аспарагиновой кислоты.

На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства:

а) каспазы-1 (каспазы 1, 4, 5),

б) каспазы-2 (каспаза-2),

в) каспазы-3 (каспазы 3, 6–10) .

Цистеиновые протеазы, по-видимому, участвуют также в ПКС у растений. Однако апоптоз возможен и без участия каспаз: сверхсинтез белков-промоторов апоптоза Bax и Bak индуцирует ПКС в присутствии ингибиторов каспаз.

В результате действия каспаз происходит:

· активация прокаспаз с образованием каспаз;

· расщепление антиапоптозных белков семейства Bcl-2. Подвергается протеолизу ингибитор ДНКазы, ответственный за фрагментацию ДНК. В нормальных клетках апоптозная ДНКаза CAD (caspase-activated DNase) образует неактивный комплекс с ингибитором CAD, обозначаемым ICAD. При апоптозе ингибитор ICAD с участием каспаз 3 или 7 инактивируется, и свободная CAD, вызывая межнуклеосомальные разрывы хроматина, ведет к образованию фрагментов ДНК с молекулярной массой, кратной молекулярной массе ДНК в нуклеосомных частицах – 180-200 пар нуклеотидов. Апоптоз возможен и без фрагментации ДНК. Обнаружен ядерный белок Acinus (apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus), из которого при комбинированном действии каспазы-3 и неидентифицированной протеазы образуется фрагмент. Этот фрагмент в присутствии дополнительных неядерных факторов вызывает апоптотическую конденсацию хроматина и фрагментацию ядра (кариорексис) без фрагментации ДНК;

· гидролиз белков ламинов, армирующих ядерную мембрану. Это ведет к конденсации хроматина;

· разрушение белков, участвующих в регуляции цитоскелета;

· инактивация и нарушение регуляции белков, участвующих в репарации ДНК, сплайсинге мРНК, репликации ДНК.

Мишенью каспаз является поли(ADP-рибозо)полимераза (ПАРП). Этот фермент участвует в репарации ДНК, катализируя поли(ADP-рибозилирование) белков, связанных с ДНК. Донором ADP-рибозы является NAD+. Активность ПАРП возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Апоптотическая гибель клетки сопровождается расщеплением ПАРП каспазами. Чрезмерная активация ПАРП при массированных разрывах ДНК, сильно снижая содержание внутриклеточного NAD+, ведет к подавлению гликолиза и митохондриального дыхания и вызывает гибель клетки по варианту некроза.

Пути реализации программы ПКС (программируемая клеточная смерть).

1. Среди них важное место занимает путь, опосредованный физиологическими индукторами, действие которых реализуется через клеточные рецепторы плазматической мембраны, специально предназначенные для включения программы апоптоза. Этот путь передачи сигнала ПКС схематически можно изобразить следующим образом: индукторы ’ рецепторы ’ адаптеры ’ каспазы первого эшелона ’ регуляторы ’ каспазы второго эшелона. Так, рецептор, обозначаемый Fas, взаимодействуя с соответствующим лигандом (лигандом FasL), трансмембранным белком Т-киллера, активируется и запускает программу смерти клетки, инфицированной вирусом. Тем же путем при взаимодействии с лигандом FasL на поверхности ТН-1-лимфоцитов или с антителом к Fas-рецептору погибают ставшие ненужными выздоровевшему организму В-лимфоциты, продуценты антител, несущие Fas-рецептор. FasL– лиганд, относящийся к многочисленному семейству фактора некроза опухолей TNF. Это семейство гомотримерных лигандов, кроме FasL и TNFa , включает TNFb (лимфотоксин).

Fas – член семейства рецепторов TNF. Все они представлены трансмембранными белками, которые внеклеточными участками взаимодействуют с тримерами лигандов-индукторов. И их взаимодействие запускает в клетке- мишени процесс апоптоза. Тому же способствует и белок перфорин, который выделяется Т-киллерами и образует каналы в мембране клетки-мишени: через эти каналы в клетку проникают протеолитические ферменты гранзимы. Это так называемый инструктивный апоптоз, который абсолютно необходим для нормальной работы иммунной системы млекопитающих. Ключевыми молекулами инструктивного апоптоза являются рецепторы смерти. Лиганды рецепторов смерти представляют собой триммеры. Триммер лиганда связывается с тремя молекулами рецептора, вызывая его триммеризацию. Рецептор имеет цитоплазматический хвост, содержащий домены смерти. От них сигнал поступает к адапторным белкам, которые активируют каспазы – ферменты апоптоза (рис.46.).

Одним из наиболее изученных рецепторов смерти является рецептор Fas, воспринимающий сигнал, который доходит каспазы – 8. Он инициирует апоптоз, активируя другие каспазы – эффекторные. Эти каспазы разрушают клеточные структуры. Таким образом, каспаза – 8 + каспазы–эффекторные это «орудия» апоптоза, а ядерные и цитоплазматические белки – «мишени» каспаз.

Fas и его лиганд (Fas-L) – важные эффекторные молекулы. Ими обладают и используют их цитотоксические иммуноциты в защитной реакции против раковых клеток и клеток, пораженных вирусами.

Чтобы не допустить несвоевременный апоптоз, передачу сигнала через рецепторы смерти контролируют ряд клеточных механизмов:

существуют специальные белки, препятствующие спонтанной агрегации молекул рецептора;

существуют рецепторы-приманки, не содержащие полноценного домена смерти или лишенные цитоплазматического хвоста.

Fas и его лиганд также важны для элиминации активированных иммуноцитов, попавших в иммуннопривилегированные органы – семенники и глаза.

Взаимодействие рецептора и лиганда приводит к образованию кластеров рецепторных молекул и связыванию их внутриклеточных участков с адаптерами.

Адаптер, связавшись с рецептором, вступает во взаимодействие с эффекторами, пока еще неактивными предшественниками протеаз из семейства каспаз первого эшелона (инициирующих каспаз).

Взаимодействие адаптера с рецептором и эффектором осуществляется через гомофильные белок-белковые взаимодействия небольших доменов: DD (death domain – домен смерти), DED (death-effector domain – домен эффектора смерти), CARD (– домен активации и рекрутирования каспазы). Все они имеют сходную структуру, содержат по шесть a-спиральных участков. Домены DD(домен смерти) участвуют во взаимодействии рецептора Fas c адаптером FADD (Fas-associated DD-protein). Домены DED участвуют во взаимодействии адаптера FADD с прокаспазами 8 и 10.

Рис.46. Общая схема передачи сигнала через рецепторы смерти.

Наиболее подробно охарактеризована прокаспаза-8, рекрутируемая рецептором Fas через адаптeр FADD. Образуются агрегаты FasL – Fas – FADD – прокаспаза-8. Подобные агрегаты, в которых происходит активация каспаз, названы апоптосомами, апоптозными шаперонами, или сигнальными комплексами, индуцирующими смерть.

Прокаспазы обладают незначительной протеолитической активностью, составляющей 1–2% активности зрелой каспазы. Будучи в мономерной форме, прокаспазы, концентрация которых в клетке ничтожна, находятся в латентном состоянии. Предполагается, что пространственное сближение молекул прокaспаз при их агрегации ведет к образованию активных каспаз через механизм протеолитического само- и перекрестного расщепления (ауто- или транс-процессинга). В результате от прокаспазы (молекулярная масса 30–50 кДа) отделяется регуляторный N-концевой домен (продомен), а оставшаяся часть молекулы разделяется на большую (~20 кДа) и малую (~10 кДа) субъединицы. Затем происходит ассоциация большой и малой субъединиц. Два гетеродимера образуют тетрамер с двумя каталитическими участками, действующими независимо друг от друга. Таким образом, прокаспаза-8 активируется и высвобождается в цитоплазму в виде каспазы-8. Существуют другие пути активации каспазы-8 – с участием рецепторов TNFR1 и DR3.

На этапе активации каспаз первого эшелона жизнь клетки еще можно сохранить. Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают разрушительное действие каспаз первого эшелона. К ним относятся белки Bcl-2 (ингибиторы апоптоза: A1, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Bax (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Bax, Bcl-XS, Bid, Bik, Bim, Hrk, Mtd). Эти белки эволюционно консервативны: гомолог Bcl-2 обнаружен даже у губок, у которых апоптоз необходим для морфогенеза.

Каспаза-8 активирует каспазу второго эшелона (эффекторную каспазу): путем протеолиза из прокаспазы-3 образуется каспаза-3, после чего процесс, запущенный программой смерти, оказывается необратимым.

Каспаза-3 способна в дальнейшем к самостоятельной активации (автокатализу или автопроцессингу), активирует ряд других протеаз семейства каспаз, активирует фактор фрагментации ДНК, ведет к необратимому распаду ДНК на нуклеосомальные фрагменты. Так запускается каскад протеолитических ферментов, осуществляющих апоптоз.

2. Второй путь реализации программы ПКС связан с митохондриальным цитохромом c. В клетках, подвергшихся воздействию индуктора апоптоза, резко снижается мембранный потенциал (Dy) митохондрий. Падение Dy обусловлено увеличением проницаемости внутренней мембраны митохондрий вследствие образования гигантских пор. Существует много факторов, вызывающих раскрытие пор. К ним относятся истощение клеток восстановленным глутатионом, NAD(P)H, ATP и ADP, образование активных форм кислорода, разобщение окислительного фосфорелирования протонофорными соединениями, увеличение содержания Ca²⁺ в цитоплазме. Образование пор в митохондриях можно вызвать церамидом, NO, каспазами, амфипатическими пептидами, жирными кислотами. Поры имеют диаметр 2,9 нм, позволяющий пересекать мембрану веществам с молекулярной массой 1,5 кДа и ниже. Следствием раскрытия пор является набухание митохондриального матрикса, разрыв наружной мембраны митохондрий и высвобождение растворимых белков межмембранного объема. Среди этих белков – ряд апоптогенных факторов: цитохром с, прокаспазы 2, 3 и 9, белок AIF (apoptosis inducing factor), представляющий собой флавопротеин с молекулярной массой 57 кДа.

Образование гигантских пор не является единственным механизмом выхода межмембранных белков митохондрий в цитоплазму. Предполагается, что разрыв наружной мембраны митохондрий может быть вызван гиперполяризацией внутренней мембраны. Возможен и альтернативный механизм, без разрыва мембраны, – раскрытие гигантского белкового канала в самой наружной мембране, способного пропускать цитохром с и другие белки из межмембранного пространства.

Высвобождаемый из митохондрий цитохром с вместе с цитоплазматическим фактором APAF-1 (apoptosis protease activating factor-1) участвует в активации каспазы-9. APAF-1 – белок с молекулярной массой 130 кДа, содержащий CARD-домен (caspase activation and recruitment domain) образует комплекс с прокаспазой-9 в присутствии цитохрома с и dATP или АТР. Из этих субъединиц собираются жесткие, симметричные структуры, наподобие веера или пропеллера. APAF-1 играет роль арматуры, на которой происходит аутокаталитический процессинг каспазы-9. Предполагается, что в результате зависимого от гидролиза dATP (или АТР) конформационного изменения APAF-1 приобретает способность связывать цитохром с (рис.47). Связав цитохром с, APAF-1 претерпевает дальнейшее конформационное изменение, способствующее его олигомеризации и открывающее доступ CARD-домена APAF-1 для прокаспазы-9, которая тоже содержит CARD-домен. Так образуется конструкция, называемая также апоптосомой, с молекулярной массой > 1,3 млн дальтон, в составе которой – не менее 8 субъединиц APAF-1. Благодаря гомофильному CARD-CARD-взаимодействию с APAF-1 в эквимолярном соотношении связывается прокаспаза-9, а затем прокаспаза-9 связывает прокаспазу-3. Пространственное сближение молекул прокаспазы-9 на мультимерной арматуре из APAF-1-цитохром-с-комплексов, по-видимому, приводит к межмолекулярному протеолитическому процессингу прокаспазы-9 с образованием активной каспазы-9. Зрелая каспаза-9 затем расщепляет и активирует прокаспазу-3.