Методы генной инженерии

Понятие о генной инженерии. Рекомбинантные ДНК, принципы их конструирования. Клонирование фрагментов нуклеиновых кислот in vivo. Определение по нятия вектора в биологии. Векторы: плазмиды, бактериофаги, космиды, искусственные хромосомы. Методы поиска специфических рекомбинантных ДНК. Геномные ДНК-библиотеки, библиотеки кДНК.

Трансгенные организмы. Принцип конструирования трансгенных организмов. Трансгенные бактерии. Главные направления применения в народном хозяйстве и медицине. Рекомбинантные лекарственные препараты. Трансгенные растения. Главные направления использования трансгенных растений. Трансгенные животные как модели заболеваний и биореакторы. Проблемы экологической безопасности.

Генная терапия. Принципы генной терапии. Генотерапия ex vivo и in vivo. Вирусные и невирусные векторы в генотерапии. Перспективы и ограничения генной терапии. Генные вакцины. Генная терапия в онкологии.

Генная инженерия. Технология рекомбинантных ДНК. Генная инженерия возникла в 1972 году, в Станфордском университете, в США. Тогда лаборатория П. Берга получила первую рекомбинатную (гибридную) ДНК или рекДНК. Она соединяла в себе фрагменты ДНК фага лямбда, кишечной палочки и обезьяньего вируса SV40.

В начале 1970-х молекулярные биологи разработали принципиаль­но новые технологии, основанные на открытиях в области биохимии и молекулярной генетики. Это предоставило огромные возможности манипулирования генетическим материалом. Новые подходы и методы получили название «технологии рекомбинантных ДНК», часто называе­мые «генной инженерией». Эти технологии революционизировали био­логию и оказали огромное влияние на медицину. С их помощью можно производить обмен генетической информацией между хромосомами, создавая новые геномы. Например, можно получать трансгенные орга­низмы, бактерии, экспрессирующие гены человека, проводить генную терапию человека и др. Таким образом, генная инженерия — это раздел молекулярной генетики, использующий различные методы манипуля­ций с нуклеиновыми кислотами (технологии рекомбинантных ДНК) для целенаправленного изменения генетических программ и создания новых генотипов. Генная инженерия состоит из следующих основных этапов: а) полу­чение генетического материала, содержащего нужные гены; б) включе­ние этих генов в автономную генетическую систему (вектор), способную к репликации и встраиванию в чужой геном; в) введение этой системы в реципиентную клетку, где новые гены входят в состав ДНК. На ука­занных этапах используется много молекулярно-генетических подходов и методов. Рассмотрим некоторые из них.

Генетический материал можно получать двумя способами: путем химического синтеза и путем ферментативной рестрикции ДНК.

Химический синтез ДНК осуществляется из нуклеотидов в спе­циальных условиях (рис.55 А) на основе полностью расшифрован­ной нуклеотидной

Рис.55. Схемы путей синтеза генетического материала

А - синтез из нуклеотидов; Б - синтез на основе обратной транскрипции мРНК: 1 - получение мРНК из клеток; 2 — обратная транскрипция; 3 — образование двухцепочечной кДНК

последовательности определенного участка ДНК. Искусственный ген аланиновой тРНК был впервые синтезирован Г. Кораной в 1970 г. Этот ген состоял из 77 пар нуклеотидов, но не имел регуляторных отделов и поэтому не функционировал. Спустя не­сколько лет Корана синтезировал ген тирозиновой тРНК, содержащий промотор и терминатор. Этот ген, введенный бактериям, функциони­ровал как натуральный. В настоящее время синтезировано уже много разнообразных генов.

Синтез некоторых генов можно проводить также с помощью мРНК и ферментов обратной транскрипции (рис.55 Б). В определенных условиях на матрице мРНК с помощью специальных ферментов ревертаз синтезируется комплементарная цепь ДНК. Затем на ней как на матрице образуется вторая цепь ДНК. Такая искусственно полученная молекула называется ДНК-копией или кДНК.

Рестрикция ДНК— это процесс «разрезания» молекул ДНК про­кариот и эукариот специальными ферментами, что позволяет получать участки, содержащие определенные гены.

Одним из важнейших инструментов генной инженерии являются эндонуклеазы — ферменты, расщепляющие ДНК по специфическим по­следовательностям нуклеотидов внутри цепи. Эти ферменты получили название рестриктаз. Рестриктазы расщепляют ДНК на относительно небольшие фрагменты в участках строго определенных последова­тельностей (рис.56). Этим их воздействие отличается от большинства других ферментативных, химических или физических воздействий, приво­дящих к случайным разрывам цепей ДНК. Рестриктазы (уже открыто более 200 типов ферментов этого класса) являются

Рис.56. Схема рестрикции ДНК (А) и образование рекомбинантной (химерной) ДНК (Б): 1. Рестриктазы распознают определенные нуклеотидные последовательности ДНК и «разрезают» ее в местах, обозначенных стрелками. 2. Фрагмент исходной ДНК с «липкими концами», готовыми к комплементарному взаимодействию. 3. Фрагмент «чужой» ДНК, полученный также после рестрикции тем же видом рестриктаз. 4. Рекомбинантная (химерная) ДНК, состоящая из «своих» и «чужих» генов

частью защитной системы бактерий, охраняющих собственный геном от чужеродной, главным образом вирусной ДНК. Рестриктазы принято именовать по названию бактерий, из которых их выделяют. Так, название EcoRI свидетельствует о том, что этот фермент из Esherichia coli. ВатН1 — из Bacillus amilolquefacientsi. Каждый фермент узнает определенную 4-7-членную последовательность в двухцепочечной ДНК. Разрезание ДНК по этим сайтам приводит к образованию либо «тупых» (например, при действии рестриктаз Hpal), либо «липких», то есть перекрывающихся (например, ВатН1), концов. Для конструирования гибридных молекул особенно удобны липкие концы (рис.56). Любой фрагмент ДНК об­ладает характерным расположением сайтов узнавания различных ре­стриктаз, что позволяет строить так называемые рестриктазные карты. При расщеплении ДНК какой-либо одной рестриктазой получают смесь фрагментов, каждый из которых имеет одни и те же концевые участ­ки. Такие фрагменты можно разделить и идентифицировать методом электрофореза в агарозном или полиакриламидном геле.

Биологические векторы: (плазмиды, бактериофаги, космиды, искусственные хромосомы).

Вектор — это нечто вроде молекулярного «такси», способного пере­носить чужую ДНК внутрь клетки-хозяина таким образом, чтобы она там могла реплицироваться.

Вектор, включающий в себя фрагменты чужеродной ДНК, должен проникать в реципиентные клетки, выбранные для клонирования гена. Эти клетки могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их легко получать в большом количестве. Встроенные в плазмиды чужие гены переда­ются в клетку хозяина путем трансдукции и встраиваются в их геном, где способны к быстрой репликации с помощью ферментов клетки-хозяина. Процесс быстрого получения большого количества оди­наковых копий молекул называется клонированием. Клон — это большая популяция идентичных молекул, клеток, организмов, полученных от одного предка. Путем клонирования вектора в реципиентных клетках можно обеспечить получение большого количества нужного гена в высокоочищенном виде или большого количества белка, кодируемого данным геном. В геном животных фрагменты чужой ДНК вводят путем микроинъекции непосредственно в ядро клетки.

Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды и бактериофаги.

Бактериальные плазмиды — это небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК, в функции которых входит, например, обеспече­ние устойчивости к антибиотикам. Плазмиды обладают несколькими свойствами, которые делают их чрезвычайно удобными для использова­ния в качестве векторов. В частности в бактериальной клетке они могут существовать во множестве копий, могут реплицироваться независимо от хозяйской ДНК. Для многих плазмид известна полная нуклеотидная последовательность. Это делает возможным точную локализацию сайтов рестрикции для клонирования фрагментов ДНК. Плазмиды значительно меньше хозяйской хромосомной ДНК и поэтому могут быть легко отделены от нее. Клонированный фрагмент легко выделяется из рекомбинантной плазмиды посредством ее расщепления той же рестриктазой.

Бактериофаги обычно содержат линейную ДНК, в которую могут быть встроены фрагменты чужеродной ДНК по какому-либо из доступных сайтов рестрикции. Основным преимуществом фаговых векторов перед плазмидными является то, что в них удается встраивать в 2-3 раза более крупные фрагменты «чужой» ДНК.

Рис.57. Схема основных этапов и методов генной инженерии:

1 — получение ДНК из ядер; 2 — рестрикция ДНК на фрагменты (фрагмент 6 содержит интересующий нас ген); 3 — разделение фрагментов с помощью электрофореза; 4 — идентификация интересую­щего нас фрагмента методом гибридизации со специальным ДНК-зондом; 5 — выделение нужного фрагмента; 6 — синтез нужного фрагмента; 7 — клонирование фрагментов мето­дом ПЦР; 8 — включение фрагмента ДНК в плазмиду (вектор); 9 — введение плазмиды в бактерию; 10 — введение фрагмента ДНК непосредственно в ядро клетки реципиента; 11 — рестрикция плазмиды; 12 — включение в плазмиду фрагмента ДНК

Необходимые гены вырезаются из хромосом животных, инкуби­руются с плазмидами или фагами, которые также разрезаны специ­альными рестриктазами (рис.56 и 57). Через некоторое время фрагменты разных ДНК соединяются в соответствии с принципом комплементарности и ДНК плазмиды восстанавливает исходную кольцевую форму. Так можно соединять отрезки ДНК, полученные из разных клеток и создавать комбинации разнообразных генов в одной молекуле. Для соединения участков ДНК применяют лигазу — один из ферментов репарации. Процесс ковалентного соединения «липких» концов фрагментов ДНК называют «лигированием». Используя раз­личные рестриктазы и лигазы, можно разрезать и сшивать нить ДНК в разных местах и получать разнообразные рекомбинантные (химер­ные) молекулы.

Космиды. Векторы, называемые космидами, могут включать до 40 тысяч пар нуклеотидов чужеродной ДНК и при этом активно амплифицироваться в Е. coli как плазмиды. Космиды обьединяют в себе свойства плазмидных векторов и векторов на основе фага λ. Например, широко применяемая космида pLFR-5 (приблизительно 6 тысяч пар нуклеотидов) имеет два cos-сайта фага λ, точку начала репликации ДНК и ген устойчивости к тетрациклину. Эта космида может интегрировать чужеродную ДНК, длина которой до 40 тысяч пар нуклеотидов.

Оказавшись в бактериальной клетке, линейная молекула pLFR-5 со вставкой замыкается в кольцо благодаря спариванию cos-сайтов. В такой стабильной конфигурации она может долгое время существовать в клетке и реплицироватся как гибридная плазмида, поскольку содержит все необходимые для этого элементы. Более того, ген устойчивости к тетрациклину обеспечивает рост колоний, несущих данную космиду, на среде с этим антибиотиком; трансформированные клетки при этом погибают. Существуют и другие космидные векторы на основе фага λ.

Космиды имеют большое преимущество по сравнению с плазмидами: в них можно встраивать более длинные фрагменты ДНК, а это означает, что для создания геномной библиотеки нужно меньшее число клонов и потребуется меньше времени на их скрининг.

Векторные системы, способные интегрировать крупные вставки (>100 тысяч пар нуклеотидов) имеют большую ценность

при анализе сложных эукариотических генов. Без таких векторов не обойтись, например, при картировании генома человека. В отличие от библиотек с небольшими вставками чаще всего будет представлен весь генетический материал организма. Кроме того, в этом случае уменьшается число клонов, которое нужно поддерживать, и увеличивается вероятность того, что каждый из генов будет присутствовать в «своем» клоне.

Искусственные хромосомы. Для клонирования фрагментов ДНК размером от 100 до 3000 тысяч пар нуклеотидов был сконструирован низкокопийный плазмидный вектор на основе бактериофага Р1. Это химерная конструкция, называемая искусственной хромосомой. Был создан также очень стабильный вектор, способный интегрировать вставки длиной от 150 до 300 тысяч пар нуклеотидов, на основе F- плазмиды E.coli, которая представлена в клетке одной или двумя копиями с селекционной системой lac Z - эта конструкция называется бактериальной искусственной хромосомой.

Искусственные хромосомы содержат три основных элемента: концевые участки (теломеры), центромеру и точки инициации репликации. Свойства теломерных областей хромосом человека хорошо изучены, чего нельзя сказать о центромерах и точках инициации репликации. Существовали опасения, что искусственные хромосомы не удастся сконструировать, пока не будут досконально изучены все ее элементы. Однако уже получены и поддерживаются в трансфицированой культуре клеток стабильные, линейные, искусственные хромосомы человека (микрохромосомы), состоящие из множества ДНК повторов (длиной около 1 миллиона пар нуклеотидов), центромерной области, высокомолекулярных фрагментов геномной ДНК и теломерных участков. В их центромерную область был встроен ген устойчивости к неомицину, что позволило использовать среду С 418 в качестве селективной.

Две из трех микрохромосом были получены «усечением» существующей хромосомы. В одном случае исходная центромера была сохранена, а в другом заменена трансфицированой центромерной областью. Третью, полностью искусственную микрохромосому получили лигированием in vitro трех трансфицированных ДНК-элементов. Ясно, что создание искусственной хромосомы человека, содержащей «терапевтические» гены, вполне реально. Основной проблемой станет доставка этой огромной молекулы ДНК в ядро клетки-мишени. Кроме, того, экспрессия генов, входящих в состав ДНК-блоков, из которых построена искусственная хромосома, может оказывать вредное воздействие на клетки-мишени. Для начала в ткани пациента можно попытаться имплантировать инкапсулированные клетки с искусственными хромосомами. Совсем недавно учеными были созданы лентивирусные векторы. Они широко используются при генетических заболеваниях, так как их структура допускает перенос больших генов, например генов гемоглобинов, факторов свертывания VIII, IX и других. Главное преимущество лентивирусных векторов перед другими ретровирусами - в возможности интеграции в геном всех клеток. Это особенно важно для переноса генов в примитивные стволовые кроветворные клетки, так как основная масса последних находится вне клеточного цикла, а мобилизация в цикл существенно сказывается на пролиферативном потенциале и судьбе стволовых кроветворных клеток при трансплантации.

Геномные библиотеки и кДНК библиотеки. Подобрав соответ­ствующие условия рестрикции и клонирования можно добиться того, что в наборе клонированных фрагментов будут содержаться практиче­ски все гены данного генома. Такие коллекции клонов, полученные от конкретного генома, называют геномными «библиотеками». Геномная библиотека готовится из тотальной ДНК клеточной линии или ткани.

В отличие от геномной библиотеки, библиотека кДНК готовится из мРНК ткани. Библиотека кДНК также состоящая из всех генов данного генома готовится в несколько этапов. Сначала выделяют тотальную мРНК ткани. Затем с помощью обратной транскриптазы и ДНК-полимеразы проводят обратную транскрипцию мРНК в двухцепочечную ДНК (кДНК). Указанные «библиотеки» используются для изучения нуклеотидной последовательности, локализации генов, их структуры и патологии.

Трансгенные организмы. Принцип конструирования. Трансгенез - искусственный перенос гена или группы генов из одного организма в другой и создание условий для его/их экспресии (т.е. выражения: транскрипции, трансляции, приводящих к появлению в клетках организма-реципиента
биологически активного генного продукта). Основой для развития исследовательских работ по межвидовому транспорту генов послужили серьезные достижения последних десяти лет в области генной инженерии - т. е. технологии манипулирования с рекомбинантной ДНК.

Его цель — получение организмов с новыми признаками, изменение наследственности сложных много­клеточных организмов. Такие организмы называют трансгенными. Для трансгенеза используют несколько методических приемов — ин­тродукция генов в изолированные клетки реципиента с последующей ретрансплантацией этих клеток, инъекция гена непосредственно в орга­низм реципиента, интродукция клонированных генов в геном эмбриона на ранних стадиях развития. Чаще всего используют последний метод. При этом из материнского организма (например, мыши) берут только что оплодотворенную яйцеклетку. В зону мужского пронуклеуса путем инъекции вводят клонированные гены, потом самкам пересаживают эмбрионы, которые развивались в культуральных средах. При этом до­стигается довольно высокий уровень имплантации и рождение полно­ценных мышей. В процессе трансгенеза происходит встраивание нового гена в геном зародыша. Вследствие этого получают животных с новым геном и они обеспечивают передачу его следующему поколению пу­тем полового размножения. Следует также учитывать, что введенный ген обычно встраивается в одну из гомологичных хромосом, поэтому трансгенными будут не все потомки. Осуществлено успешное перене­сение в геном мыши гена гормона роста человека. Масса трансгенных мышей и их потомков была в 1,5-2 раза больше. Ныне широко ведутся исследования по получению трансгенных кроликов, овец, птицы, свиней. Быстрыми темпами разрабатываются методы создания трансгенных жи­вотных, которые могут синтезировать некоторые препараты (инсулин, интерферон, факторы свертываемости крови, гормоны, незаменимые аминокислоты).

В перспективе есть возможность получать так называемых транс­генных животных, в зиготу которых будет внесено несколько генов (политрансгенные животные). Но при этом возникает опасность раз­рушения эволюционно сбалансированного генома животных.

Введение генов в клетки и их экспрессия. После растворения за­щитной оболочки протеолитическими ферментами с яйцеклеткой мож­но проводить разные манипуляции и вводить в нее микроколичества нуклеиновой кислоты. Яйцеклетку диаметром около 0,1 мм помещают на конец микропипетки, и экспериментатор с помощью микроскопа и стеклянного капилляра с внешним диаметром не более нескольких десятков микрон вводит в яйцо несколько пиколитров (10-12 пл.) чужих фрагментов ДНК. Инъекция — наиболее ответственный этап эксперимента, поскольку в этот момент можно нанести значительные повреждения яйцу или эмбриону. Наилучшая интеграция и экспрессия генов достигается при инъекции в мужской пронуклеус, что разрешает свести к минимуму повреждения ооцита, поскольку пронуклеус рас­полагается близ его мембраны. Таким образом, удается добиться вклю­чения одного или нескольких генов в геном эмбрионов млекопитающих. Эти гены могут экспрессироваться и передаваться потомкам. Следует подчеркнуть некоторые сложности и неясности, с которыми связана эта процедура. Процесс интеграции генов в геном клеток млекопитающих является малоизученным. Как показали исследования, эта интеграция происходит случайным образом и не связана с конкретным участком хромосомы. Другая сложность обусловлена нестабильностью клеток, в которые вводится ген (или гены), где он может быть утерянным, видоизмененным или неактивным. Активность генов определяется не только последовательностями нуклеотидов, которые обеспечивают транскрипцию генов с образованием мРНК, но также другими после­довательностями нуклеотидов, которые стоят отдаленно от собственно гена. Для достижения полной экспрессии гена эти последовательности необходимо вводить вместе с ним.

Трансгенные бактерии.В разных сферах хозяйственной деятельности человека используются трансгенные бактерии. Кроме того, что бактерии используются для клонирования генов и производства белка, они реконструируются и для других целей.

Так, биоинженерные бактерии используются для оздоровления растений. Бактерии, что живут в растениях и стимулируют образования кусочков льда, были изменены с холод-плюс на холод-минус растения. Такие бактерии начали защищать вегетативные части растений от мороза. У бактерий, что образуют симбиоз с корнями кукурузы, были введены гены (от других бактерий), что кодируют токсин для вредных насекомых.

В природе существуют бактерии, что могут расщеплять любое органическое вещество. Бактерии отбираются за способностью расщеплять определенное вещество, а затем эта способность усили­вается во время биотехнологии. Таким путем были образованы бактерии, которые поедают нефть, что разлилась во время техногенных катастроф.

Бактерии используют для бактериального синтеза. Так, были реконструированы бактерии для производства аминокислоты фенилаланина.

Широкое использование рекомбинантных бактерий в сельском хозяйстве, промышленности, защите окружающей среды ограничива­лось тем, что такие бактерии могут заменить природные микроорга­низмы в экосистемах с возникновением неблагоприятных последст­вий. На сегодняшний день разработаны методы определения, измере­ния и даже блокирование деятельности этих клеток в окружающей среде.

Рекомбинантные лекарственные препараты. Среди многих достижений генной инженерии, получивших применение в медицине, наиболее значительное получение человеческого инсулина в промышленных масштабах. Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, где начался синтез гормона, который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года в США, Японии, Великобритании и других странах производят генно-инженерный инсулин. Из 1000 литров бактериальной культуры получают приблизительно 200 г инсулина, что равно количеству, получаемому из 1600 кг поджелудочной железы животных. Параллельно была решена проблема иммунологического поражения организма диабетиков животным инсулином.

Более двадцати фирм Японии и несколько американских фирм разрабатывали другой очень важный медицинский препарат- интерферон, который эффективен при различных вирусных заболеваниях и злокачественных новообразованиях. Первым из этих соединений на рынок поступил альфа-интерферон, затем бета-интерферон.

Еще один эффективный противораковый препарат - интерлейкин производится в Японии и США. Интересно отметить, что сегодня американский рынок медицинских препаратов, полученных методами генной инженерии, сравним с такими массовыми лекарствами, как антибиотики.

Трансгенные растения. На начальном этапе развития исследовательских работ по трансгенезу у эукариотических организмов одной из основных проблем являлся поиск и конструирование векторов-носителей для переброски «полезных» генов. Сейчас эта проблема в значительной степени решена, что дало серьезный импульс распространению трансгенных манипуляций с растениями и животными. В отношении растений наиболее используемыми векторами - носителями являются Ti (tumor inducing) и Ri (root-inducing) плазмиды, выделенные из бактерий, способных образовывать с высшими растениями сложные симбиотические ассоциации. Ti плазмиды содержат в составе своей ДНК так называемые Т-участки (от английского transfer - перенос), способные встраиваться в ядерный геном некоторых растений. Встраивание в Т-участок нужного гена превращает Ti-плазмиду в вектор - носитель для трансгенных манипуляций. Необходимо также отметить, что генная инженерия и трансгенез у растений могут затрагивать не только ядерный наследственный материал, но и ДНК хлоропластов и митохондрий. Так, в митохондриях кукурузы были обнаружены плазмиды S-1 и S-2, что открывает определенные возможности для введения туда чужеродных генов.

В результате детального изучения молекулярно-генетических ос­нов опухолевого роста у растений при участии бактерий рода Agrobacterium оказалось, что опухолеобразующие плазмиды агробактерий (Ti - tumor inducing, индуцирующая опухоль), представляющие со­бой мини-кольцевые ДНК, являются природной векторной системой, которую сейчас используют для переноса генов в растения. Плазмида агробактерии, которая составляет 12-22 тыс. пар основа­ний, пе­реносит часть своей ДНК в ДНК растительной клетки, в которую встраивается «нужный» ген. Она кодирует ферменты синтеза фитогормонов и опинов - производных аминокислот, которые исполь­зуются бактерией как источник углерода, азота и энергии.

С помощью этого уникального вектора уже получено большое число трансгенных растений. Важно также то, что методы генной инженерии сейчас используют не только в практике, это важнейшая методология для по­знания фундаментальных основ организации и функционирования раститель­ного генома.

Перенос Т-ДНК из бактерии в цитоплазму растительной клетки осуществляется за 30 мин.

Внедрение Т-ДНК в растительный геном является многоступенчатым процессом. В геном расте­ния могут встраиваться несколько копий Т-ДНК. После встраивания в хромо­сому Т-ДНК становится обычной частью генома растения. Т-ДНК транскриби­руется в растительных клетках РНК-полимеразой II растения-хозяина. Транс­крипты имеют особенности эукариотических матриц. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном пространстве и использует расти­тельные клетки со встроенной Т-ДНК как фабрику, продуцирующую опины -источник азота и углерода.

Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по сущест­ву идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений.

Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков.

Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследует­ся как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяю­щая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены.

Простейший способ введения Т-ДНК в клетки растения состоит в том, чтобы заразить его A. tumefaciens, содержащей подходящую Ti-плазмиду, и предоставить дальнейшее естественному ходу событий. В целом идеальная векторная система на основе Ti-плазмиды должна:

· содержать все сигналы, необходимые для переноса и стабильной
интеграции в ядерную ДНК растений; систему для экспрессии чужеродных генов в растениях (узнаваемый растительными полимеразами промотор), маркер, который необходим для селекции трансформированных клеток;

· не содержать онкогенов, то есть генов, которые подавляют дифференцировку растительных клеток. Второй пункт достигается с помощью транспозонного мутагенеза.

В результате введения транспозона в Т-ДНК можно выключить гены, ко­торые приводят к опухолеобразованию, что не отражается на механизме переноса Т-ДНК. Обычно используют бактериальные транспозоны (Тп 5, Тп 7).

Кроме того, при конструировании векторных молекул должно быть пре­дусмотрено наличие промоторов, работающих в растениях. Промотор (участок, к которому присоединяются РНК-полимеразы) должен обладать набором свойств, а именно: силой (активной экспрессией), возможностью регуляции, ткане- и органспецифической экспрессией. Так, например, к регулируемым промоторам относится промотор генов белков теплового шока (генов, актив­ность которых индуцируется при повышенной температуре), а тканеспецифичная экспрессия характерна для генов, контролирующих синтез запасных бел­ков, например зеина, который обнаружен только в тканях семян злаков. Наибо­лее популярным является промотор гена вируса мозаики цветной капусты 12 (CAMV). Гены, подшитые к такому промотору, активно экспрессируются во всех тканях.

Наконец, в векторе должны быть предусмотрены маркеры, с помощью которых возможен отбор трансгенных растений. В литературе маркерные гены еще называют репортерными. Их достаточно много. Например, luxA и luxB -это гены, выделенные из ДНК светлячков. Они контролируют синтез люциферазы, которая обеспечивает переход люцефиринов из окисленной формы в ос­новную, что и обеспечивает свечение. В последнее время пользуется популяр­ностью другой репортерный ген - pgfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria. Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом.

Традиционный способ трансформации растительных клеток с помощью Т- ДНК заключается в нанесении агробактерий, содержащих Ti-плазмиду, на специально поврежденный побег. Сейчас используют широкий арсенал методов для получения трансгенных растений. Создан даже специальный прибор -«Shotgun», который стреляет мельчайшими вольфрамовыми пульками, одетыми в молекулы ДНК, осуществляя, таким образом, трансформацию растительных клеток.

Рис.58. Генетическая колонизация высшего растения бактерией A. tumefaciens: 1 - A. tumefaciens существует в ризосфере (корневой сфере) растения; 2 - в клетках бактерии наряду с ее хромосомой существует Тi-плазмида; 3 - Ti-плазмида проникает в клетку растения, и часть ее (T-ДНК) встраивается в геном растения; 4 - это приводит к образованию опухоли - корончатого галла и синтезу опинов

Экспериментаторы рассматривают почвенную бактерию как природного геноинженера. Пришлось только обезоружить ее: опухолеиндуцирующую область плазмиды удалили и заменили на искусственно сконструированный вектор, в который включен избранный чужой ген, переносимый в ядерный геном растений. Следует отметить, что все трансгенные растения получены на основе схемы агробактериального переноса (рис.58). Однако она эффективна лишь для двудольных растений. Для однодольных, в основном злаковых растений, разработаны другие способы переноса генетических конструкций, из них чаще используется баллистический - с помощью установки под названиями «генная пушка», или «дробовик». На микрочастицы золота или вольфрама помещаются ДНК-векторы и под давлением «выстреливаются» в растительные клетки.

Сейчас разрабатывается получение так называемых съедобных вакцин. Этим занимаются многие лаборатории в мире, но пока на экспериментальном уровне. На первых этапах работы получены трансгенные растения табака и люцерны с геном Р-интерферона человека, очень мощного иммуногенного фактора. Затем приступили к созданию трансгенных растений табака и люцерны с генами иммуногенных белков микобактерий, вызывающих туберкулез, и с генами оболочки вируса гепатита В. При экспрессии подобных генов в растениях, которые съедают животные, в их организме предполагается получить иммунный ответ с образованием антител на продуцируемый антиген. Иными словами, будет проведена естественная вакцинация по устойчивости к заболеванию туберкулезом или гепатитом В. В этом и заключается смысл создания съедобных вакцин.

В настоящее время у 120 видов растений существуют трансгенные формы. Разрешено использование трансгенных сои, кукурузы, хлопка, рапса, картофеля, томатов, свеклы, тыквы, табака, папай, льна; заканчиваются испытания трансгенного риса и пшеницы. Трансгенные растения выращиваются в 11 странах мира - США, Китае, Аргентине, Канаде, Австралии, Мексике, Испании, Франции, Южной Африке, Португалии и Румынии. В 2000 г. под ними была занята площадь около 40 млн. га.

С использованием трансгенных растений были решены такие проблемы, как гербицидоустойчивость, устойчивость к насекомым, к вирусам, к грибковым и бактериальным заболеваниям, регуляция сроков созревания, повышение общей продуктивности, съедобные вакцины. Сегодня выращивается 71 % трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, 22% - к вредителям и 7% - к гербицидам и вредителям (в основном соя, кукуруза, хлопок, рапс). Идет поиск подходов к резкому повышению продуктивности растений.

Ведутся работы по образованию биоинженерных растений, которые могли бы иметь следующие особенности: 1) высокую приспособительность к условиям внешней среды; 2) вмещать большее количество необхо­димых для человека питательных веществ; 3) долгое время сохранятся.

Разрабатываются трансгенные растения, которые способны проду­цировать в интересах человека химические вещества и лекарства. Реконструировано картошку для продукции альбумина человека. Предвидится, что в будущем растения смогут образовывать в своих семенах такие белки, как гормоны человека.

Трансгенные животные как модели заболеваний и биореакторы.Трансгенных животных, чьи клетки производят нужные белки, можно называть биореакторами. От них можно получать потомство, т.е. процесс воспроизводится из поко­ления в поколение.

Создание трансгенных животных начинается со «сшивки» двух генов, каждый из которых клонирован от­дельно. Один ген кодирует нужный белок, другой взят из железы или другого органа, который будет про­изводить этот белок. Например, если белок продуцируется с моло­ком, то специфическими органны­ми генами будут гены из молочной железы.

Гибридная ДНК инъецируется в оплодотворенную яйцеклетку или в эмбрион. Примерно в 5—10% слу­чаев ДНК встраивается в геном. Все яйцеклетки подсаживают в самок, а родившихся животных проверя­ют на присутствие гибридного гена. От «животного-основателя» полу­чают потомство и создают стадо.

Одним из примеров живых био­реакторов является свинья, проду­цирующая НЬ (гемоглобин) человека. «Сконструирована» она в 1991 г. Около 15% эритроцитов свиньи со­держат человеческий гемоглобин. Его можно отделять от свиного с помощью препаративных методов. Такой НЬ не содержит вирусов че­ловека. Однако в отдельных случа­ях не исключаются аллергические реакции.

Другим трансгенным животным явилась корова, которая с молоком производит человеческий лактоферрин. В результате подсадки трансгенной яйцеклетки родился бык, от которого получено много трансгенных тёлок, в последующем производящих и выделяющих лактоферрин с молоком.

Получены и другие трансгенные животные. Коза выделяет с молоком акти­ватор плазминогена, который растворяет тромбы; трансгенные кро­лики — фермент осглюкозидазу для лечения болезни Помпе; трансгенные куры несут яйца с человеческими антителами.

В 70-х годах была показана возможность получения ферментов из тканей человека и разработаны системы наблюдения за судьбой ферментов в орга­низме млекопитающих. Первые клинические испытания были проведены при различных лизосомных нарушениях: ганглиозидозе Ош типа 2 (Р-гексозаминидаза А из мочи), гликогенозе типа 2 (плацентарная а-галактозидаза), болезни Фабри (плацентарная а-галактозидаза), болезни Гоше (плацентарная р-глюкозидаза). Перед клиническим испытанием было установлено, что высокоочищенные ферменты человека гидролизуют естественный субстрат. Провер­ка показала, что ферменты обнаруживаются в печёночной ткани при их внут­ривенном или подкожном введении. При этом концентрация ферментов в крови уменьшается, а в печени повышается. Однако они не проникают в мозг в результате барьерных функций мозговых оболочек. Отсюда следует вывод о специфической доставке ферментов в клетки-мишени при каждой болезни. Доставка их в разные клеточные структуры может потребовать специфичес­кой очистки или какой-либо химической модификации фермента.

Экспериментальные разработки в области ферментотерапии наследствен­ных болезней позволили объективно оценивать захват молекул фермента ре­цепторами, гепатоцитами, клетками ретикулоэндотелиальной системы, фибробластами, клетками эндотелия сосудов и т.д. Это увеличило возможности направленных разработок лечения наследственных болезней и в первую оче­редь разработок с использованием новых методов доставки ферментов к клет­кам-мишеням в синтетических «пузырьках-носителях» или микрокапсулах— липосомах, либо естественных элементах — аутологичных эритроцитах. Такие методы доставки разрабатываются для лечения не только наследственных бо­лезней, но и других видов патологии. Направленная доставка лекарственных веществ в органы, ткани и клетки является актуальной проблемой для меди­цины в целом.

Ценным инструментом для генетических исследований стали трансгенные мыши. Они дают информацию при планирова­нии генной терапии человека. Ученые, изучающие мышечную дистрофию Дюшена, выделили ген, который отсутствует у больных. Предложен способ обеспечения больных детей дистрофином. Но что будет, если дистрофии попадет в другие ткани, или его будет образовываться очень много? Для решения этих вопросов были созданы трансгенные мыши, в мышцах которых имеется дистрофина в 50 раз больше, а также происходит продукция этого белка в других тканях. Дистрофии не вызывает у таких мышей патологических отклонений.

Трансгенные мыши выявились необходимыми при изучении злокачественных опухолей, моно­генных и мультифакториальных болезней человека. Но трансгенная технология является неточной, потому что введение ДНК не направленное на определенный локус хромосомы. Ген, что переносится, может нарушить функцию другого гена или попасть под контроль других генов. Даже если трансген встраивается в хромосому и экспрессируется, его эффект может быть перекрыт таким же геном клетки-хозяина. Поэтому была разработана технология более точного «прицеливания» гена, при котором ген, что вводится, занимает место своего двойника в хромосоме клетки хозяина. При этом используется природный процесс гомологической рекомбинации. Вследствие такой технологии заменяют инактивированым геном активный ген у мышей и следят эффект его отсутствия даже в эмбрионе. Так изучают функцию белков иммунной системы, механизм взаимодействия онкогенов в возникновении опухоли, развитии генетических заболеваний.

«Прицеливание» гена - сложная методология, она не работает в оплодотворенной клетке млекопитающих. Ген можно ввести только в клетки на ранних этапах развития зародыша, до его имплантации в стенку матки.

Животных с «исключенным» геном используют в изучении сложных заболеваний, у которых задействовано много генов. Так, например, изучают атеросклероз путем инактивации соединения генов, продукты которых контролируют липидный метаболизм.

Проблемы экологической безопасности. Считается, что трансгенез у растений и животных - наиболее перспективная биотехнология для решения продовольственной и медицинской проблем на ближайшее десятилетие. Трансгенные животные - козы, овцы, свиньи, коровы - используются для секреции под промоторами «генов молока» высокоактивных биологических веществ для медицины и фармакологии. Уже прошли лицензирование и поступили на рынок полученные через трансгенных животных антитрипсин, применяемый при легочных заболеваниях, антитромбин III для предотвращения инфарктов и инсультов, факторы свертываемости крови, белок С, обладающий защитными функциями, и ряд других.

Однако во всем мире в средствах массовой информации развернута дискуссия об опасностях применения генетически модифицированных организмов - трансгенных растений и животных. Научной основы для такой обеспокоенности нет, так как наш организм уже давно пользуется продуктами этих генов в виде пула аминокислот и коротких невоспроизводящихся фрагментов нуклеиновых кислот как основы для собственных биосинтетических процессов. Добавим, что каждое трансгенное растение, рекомендуемое к применению, проходит жесткую проверку по многим параметрам с испытанием на животных и только после этого получает лицензию.

В России и Украине также идут бурные дискуссии об опасностях использования трансгенных организмов. Однако в нашей стране пока не возделывается ни одно трансгенное растение, хотя российскими учеными уже созданы трансгенные растения более чем у 20 видов, некоторые из них сейчас проходят тщательную проверку.

Приведем две, до конца еще не решенные проблемы, связанные с использованием трансгенных растений. Первая - утечка трансгенов к другим диким видам-сородичам через спонтанную гибридизацию. Хотя этот процесс маловероятен, он не исключается. Можно представить последствия, когда гены гербицидоустойчивости вдруг окажутся у сорняков.

Так как трансгенные растения устойчивы к болезням и вредителям, то не исключается повышение устойчивости самих возбудителей болезней и тех же насекомых-вредителей, то есть их коэволюция. Это вторая проблема, последствия которой необходимо предвидеть. Возможно, что, создавая устойчивость у растений, стимулируется процесс отбора более устойчивых возбудителей и вредителей. Естественно, что трансгенез вызывает весьма ощутимые последствия, которые нужно тщательно изучать.

Генная терапия. Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекцион­ных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения ген­ных дефектов или придания клеткам новых функ­ций.

Принципы генной терапии. В зависимости от способа введения экзогенных ДНК в геном пациента генная терапия может прово­диться либо в культуре клеток (ex vivo), либо непо­средственно в организме (in vivo). Клеточная генная терапия или терапия ex vivo предполагает выделение и культивирование специфических типов клеток пациента, введение в них чужеродных генов, отбор трансфецированных клеток и реинфузию их тому же пациенту (рис.59). В настоящее время в большин­стве допущенных к клиническим испытаниям про­грамм генной терапии используется именно этот подход.

Рис.59. Генотерапия способом ex vivo. Клетки по­лучают от пациента, культивируют in vitro, прово­дят их генетическую трансформацию, отбирают нужные клоны клеток и возвращают в организм пациента. В случае опухолей клетки трансформи­руют генами, резко усиливающими иммунный от­вет организма, облучают и трансплантируют под­кожно тому же пациенту.

Генная терапия in vivo основана на прямом вве­дении клонированных и определенным образом упакованных последовательностей ДНК в специ­фические ткани больного. Особенно перспектив­ным для лечения генных болезней in vivo представ­ляется введение генов с помощью аэрозольных или инъецируемых вакцин. Аэрозольная генотерапия разрабатывается, как правило, для лечения пуль­монологических заболеваний (муковисцидоз, рак легких).

Разработке программы генной терапии предше­ствуют тщательный анализ тканеспецифической экспрессии соответствующего гена, идентификация первичного биохимического дефекта, исследование структуры, функции и внутриклеточного распреде­ления его белкового продукта, а также биохимиче­ский анализ патологического процесса. Все эти данные учитываются при составлении соответству­ющего медицинского протокола. Апробацию про­цедуры генокоррекции наследственного заболева­ния проводят на первичных культурах клеток больного, в которых в норме функционально акти­вен данный ген. На этих клеточных моделях оцени­вают эффективность выбранной системы переноса экзогенной ДНК, определяют экспрессию вводи­мой генетической конструкции, анализируют ее взаимодействие с геномом клетки, отрабатывают способы коррекции на биохимическом уровне.

Используя культуры клеток, можно разработать систему адресной доставки рекомбинантных ДНК, однако проверка надежности работы этой системы может быть осуществлена только на уровне целого организма. Поэтому такое внимание в программах по генной терапии уделяется экспериментам in vivo на естественных или искусственно полученных мо­делях соответствующих наследственных болезней у животных. Успешная коррекция генетических дефектов у таких животных и отсутствие нежела­тельных побочных эффектов генной терапии явля­ются важнейшей предпосылкой для разрешения клинических испытаний.

Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию по­следовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обес­печивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эф­фективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных — биологических моделях. Толь­ко после этого можно приступать к программе кли­нических испытаний.

Генная терапия ex vivo и in vivo. Первые клинические испытания методов ген­ной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирую­щей меланомы. Первым моногенным наследствен­ным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался на­следственный иммуннодефицит, обусловленный му­тацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентя­бря 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким забо­леванием (1: 100000), были пересажены ее собст­венные лимфоциты, предварительно трансформи­рованные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор). Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3—5 месяцев. За три года терапии в общей слож­ности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA-трансформированных Т-лимфоцитов без видимих неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бо­яться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим забо­леванием. В настоящее время клинические испыта­ния генной терапии этого заболевания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.

В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов уже составляло 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации. Большинство таких проектов (около 80%) каса­ются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). Вместе с тем и в совре­менных исследованиях по генной терапии необхо­димо учитывать, что последствия манипулирования генами или рекомбинантными ДНК in vivo изучены недостаточно.

В странах с наиболее продвинутым уровнем ис­следований в этой области, особенно в США, меди­цинские протоколы с использованием смысловых последовательностей ДНК подвергаются обяза­тельной экспертизе в соответствующих комитетах и комиссиях.

Вирусные и невирусные векторы в генотерапии. Решающим условием успешной генотерапии яв­ляется обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужерод­ного гена в клетки-мишени, обеспечение длитель­ного функционирования его в этих клетках и созда­ние условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с ис­пользованием чистой («голой» — naked) ДНК, леги­рованной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), ор­ганическими полимерами (DEAE-декстран, поли­лизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.

Основные методы доставки чужеродных генов в клетки разделяются на химические, физические и биологические. Только вирусные векторы или генетические конст­рукции, включающие вирусные последовательнос­ти, способны к активной трансдукции, а в некото­рых случаях и к длительной экспрессии чужеродных генов. Из более 175 уже одобренных протоколов клинических испытаний по генотерапии более 120 предполагают использовать вирусную трансдукцию и около 100 из них основаны на применении ретровирусных векторов.

Обзор литературных данных позволяет прийти к заключению, что, несмотря на усилия многих лабораторий мира, все уже известные и испытанные in vivo и in vitro век­торные системы далеки от совершенства. Если проблема доставки чужеродной ДНК in vitro прак­тически решена, а ее доставка в клетки-мишени разных тканей in vivo успешно решается (главным образом путем создания конструкций, несущих ре-цепторные белки, в том числе и антигены, специ­фичные для тех или иных тканей), то другие харак­теристики существующих векторных систем — стабильность интеграции, регулируемая экспрес­сия, безопасность — все еще нуждаются в серьезных доработках.

Прежде всего, это касается стабильности интег­рации. До настоящего времени интеграция в геном достигалась только при использовании ретровирусных либо аденоассоциированных векторов. Повысить эффективность стабильной ин­теграции можно путем совершенствования генных конструкций типа рецептор-опосредованных сис­тем (рис.60) либо путем создания достаточно ста­бильных эписомных векторов (то есть ДНК-струк­тур, способных к длительной персистенции внутри ядер).

Рис.60. Рецептор-опосредованный перенос гена. ДНК-последовательность нужного гена соединя­ют с определенным мембранным рецептором (например, сиалогликопротеином в случае кле­ток печени), а также с аденовирусом, обеспечива­ющим проникновение генной конструкции в ядро клетки. Такой комбинированный вектор обеспе­чивает эффективную адресную доставку гена в клетки печени.

В последнее время особое внимание уделяет­ся созданию векторов на базе искусственных хромо­сом млекопитающих. Благодаря наличию основных структурных элементов обычных хромосом такие мини-хромосо­мы длительно удерживаются в клетках и способны нести полноразмерные (геномные) гены и их естественные регуляторные элементы, которые необходи­мы для правильной работы гена, в нужной ткани и в должное время.

Перспективы и ограничения генной терапии. Успех первых клинических испытаний явился мощным стимулом для ускорения развития новых генотерапевтических методов применительно к другим наследственным болезням

Появление принципиально новых технологий, позволяющих активно манипулировать с генами и их фрагментами и обеспечивающих адресную до­ставку новых блоков генетической информации в заданные участки генома, стало важным событием в биологии и медицине. Уже сейчас на современном уровне знаний о ге­номе человека теоретически вполне возможны та­кие его модификации с целью улучшения некото­рых физических (например, рост), психических и интеллектуальных параметров. Таким образом, со­временная наука о человеке на своем новом витке развития вернулась к идее улучшения человеческой породы, когда-то постулированной выдающимся английским генетиком Ф. Гальтоном и развитой его учениками и последователями в Великобритании (К. Пирсон, Л. Пенроуз, Дж. Холдэйн), в России (Н.К. Кольцов, Ф.П. Филипченко), в США (Г. Мёллер). Дальнейший ход истории, как известно, пол­ностью дискредитировал саму идею улучшения че­ловеческой породы. Однако грядущее всевластие человека над собственным геномом заставляет вновь и вновь возвращаться к этой теме, делает ее предметом постоянных оживленных дискуссий в широкой и научной печати. Не вызывает сомне­ния, что первоначальные опасения, связанные с генной инженерией человека, были неоправданны. Уже признано целесообразным применение генной терапии для лечения многих заболеваний. Единст­венным и непременным ограничением, сохраняю­щим свою силу и в современных условиях, является то, что все генотерапевтические мероприятия долж­ны быть направлены только на конкретного боль­ного и касаться исключительно его соматических клеток.

Генная инженерия возможна на уровне зародышевых клеток. Профилактика наследственных болезней может быть наиболее полной и эффективной, если в зиготу будет встроен ген, по функции заменяющий мутантный ген. Устранение причины наследственной болезни (а именно это и есть наиболее глубокий подход к профилактике) означает достаточно серьез­ное «маневрирование» с генетической информацией в зиготе. Это могут быть введение нормального аллеля в геном путём трансфекции, обратная мутация патологического аллеля, «включение» нормального гена в работу, если он бло­кирован, «выключение» мутантного гена. Сложности этих задач очевидны, не интенсивные экспериментальные разработки в области генной инженерии свидетельствуют о принципиальной возможности их решения. Вопрос о ген­но-инженерной профилактике наследственных болезней является уже не уто­пией, а перспективой, хотя и не близкой.

Предпосылки для коррекции генов человека в зародышевых клетках уже созданы. Их можно обобщить в виде следующих положений.

Первичная расшифровка генома человека завершена, особенно на уров­не секвенирования нормальных и патологических аллелей. Можно надеяться, что для большинства наследственных болезней мутации будут секвенированы в ближайшие годы. Интенсивно развивается функциональная геномика, бла­годаря которой будут известны межгенные взаимодействия.

Любые гены человека нетрудно получать в чистом виде на основе хи­мического или биологического синтеза. Интересно отметить, что ген глобина человека был одним из первых искусственно полученных генов.

Разработаны методы включения генов в геном человека с разными векто­рами или в чистом виде путём трансфекции.

Методы направленного химического мутагенеза позволяют индуцировать специфические мутации в строго определённом локусе (получение обратных мутаций — от патологического аллеля к нормальному).

Получены доказательства в экспериментах на разных животных транс­фекции отдельных генов на стадии зигот (дрозофила, мышь, коза, свинья и др.). Введенные гены функционируют в организме-реципиенте и передаются по наследству, хотя и не всегда по законам Менделя. Например, ген гормона роста крыс, введённый в геном зигот мышей, функционирует у родившихся мышей. Такие трансгенные мыши значительно больше по размерам и массе по сравнению с нормаль­ными.

Генно-инженерная профилак­тика наследственных болезней на уровне зигот разработана пока сла­бо, хотя выбор способов синтеза генов и способов их «доставки» в клетки уже достаточно широк. Решение вопросов трансгеноза у человека сегодня упирается не только в генно-инженерные труд­ности, но и в этические пробле­мы. Ведь речь идёт о «композиции» новых геномов, которые создают­ся не эволюцией, а человеком. Эти геномы вольются в генофонд че­ловечества. Какова будет их судь­ба с генетической и социальной точки зрения? Будут ли они фун­кционировать как нормальные геномы? Готово ли общество принять на себя последствия неудачных исходов? Сегодня ответить на эти вопросы трудно, а без ответа на них нельзя начинать клинические испытания. Ведь речь идёт о безвозвратном вмешательстве в геном человека. Без объективной оценки эво­люционных последствий генной инженерии нельзя применять эти методы на человеке (даже и с медицинскими целями на стадии зигот). Генетика человека ещё далека от полного понимания всех особенностей функционирования ге­нома. Неясно, как геном будет работать после введения в него дополнитель­ной генетической информации, как он будет вести себя после мейоза, редук­ции числа хромосом, в сочетании с новой зародышевой клеткой и т.п.

Все сказанное выше дало основание специалистам в области биомедицинс­кой этики на международном уровне, включая ВОЗ, ЮНЕСКО, Совет Евро­пы, временно воздержаться от проведения экспериментов, а тем более клини­ческих испытаний с трансгенозом зародышевых клеток.

Современный уровень знаний не позволяет про­водить коррекцию генных дефектов на уровне по­ловых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусст­венными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем в научной ли­тературе все чаще и настойчивее раздаются призы­вы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток че­ловека.

Вот некоторые вопросы, которые должны быть решены в рамках предлагаемой генетиками широ­кой дискуссии по генной терапии.

Сможет ли в будущем генная терапия обеспе­чить столь полноценную генокоррекцию, которая не представит угрозы для потомства?

В какой мере полезность и необходимость генотерапевтической процедуры для одной супружес­кой четы перевесят риск такого вмешательства для всего человечества?

Сколь оправданны будут эти процедуры на фоне грядущего перенаселения планеты?

Как будут соотноситься генноинженерные мероприятия на человеке с проблемами гомеостаза общества и биосферы?

Таким образом, генетическая революция, апо­феозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наслед­ственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.

Генные вакцины (ДНК-вакцины). Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы:

· живые аттенуированные вакцины;

· инактивированные вакцины;

· вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов;

· рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов,
полученные методом генной инженерии.

Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку. В 1990г. в некоторых исследовательских лабораториях приступили к разработке новых вакцин, которые основаны на введении «голой» молекулы ДНК. Уже в 1992-1993 гг. несколько независимых групп исследователей в результате эксперимента доказали, что введение чужеродной ДНК в организм животного способствует формированию иммунитета. Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными, генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых кислот.

На совещании специалистов по генным вакцинам, проведенном в 1994 г. под эгидой ВОЗ, было решено отдать предпочтение термину «вакцины из нуклеиновых кислот» с их подразделением соответственно на ДНК - и РНК - вакцины. Такое решение основывалось на том, что употребление термина «ДНК - вакцина» не сформирует ошибочное мнение о том, что новые вакцины вносят изменения в генетические структуры организма вакцинируемого человека. Тем не менее, многие специалисты считают более точным термин «генные вакцины» (поскольку иммунная реакция направлена не против ДНК, а против антигенного белка, кодируемого геном), который также часто применяют. Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной.

Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека. ДНК-вакцины можно вводить в солевом растворе обычным парентеральным способом (внутримышечно, внутрикожно). При этом большая часть ДНК поступает в межклеточное пространство и только после этого включается в клетки. Применяют и другой метод введения, используя так называемый генный пистолет. Для этого ДНК фиксируют на микроскопических золотых гранулах (около 1-2 мкм), затем с помощью устройства, приводимого в действие сжатым гелием, гранулы «выстреливают» непосредственно внутрь клеток. Следует отметить, что аналогичный принцип введения лекарства с помощью струи сжатого гелия используют и для разработки новых способов доставки лекарственных средств (с этой целью оптимизируют размеры частиц лекарственного вещества и их плотность для достижения необходимой глубины проникновения в соответствующую ткань организма). Этот метод требует очень небольшого количества ДНК для иммунизации. Если при иммунизации классическими субъединичными вакцинами вводят микрограммы протеина, то при использовании ДНК-вакцины — нанограммы и даже меньше. Говоря о минимальном количестве ДНК, достаточном для индукции иммунного ответа, С.А. Джонстон, директор Центра биомедицинских изобретений Техасского университета, в журнале «The Scientist» (1998) отмечает, что с помощью генного пистолета можно однократно ввести мыши «фактически 27 тыс. различных плазмид и получить иммунный ответ на индивидуальную плазмиду». Последующие эксперименты подтвердили способность ДНК-вакцин формировать иммунитет в отношении разнообразных возбудителей. ДНК-вакцины обладают рядом преимуществ по сравнению с традиционными вакцинами.

Осознание перспективности применения генных вакцин способствовало значительному увеличению финансирования исследований в этом направлении не только со стороны государственных организаций, но и частных компаний. Характерным примером может служить небольшая американская биотехнологическая фирма «Vical Inc.», которая одной из первых приступила к разработке ДНК-вакцин. Побудительным фактом для работы в этом направлении послужили результаты одного эксперимента, проведенного в лаборатории «Vical Inc.» в 1989г., когда исследователи случайно установили, что введение «голой» вирусной ДНК мышам приводит к продукции большого количества вирусных белков. После этого фирма запатентовала метод прямого введения «голой» ДНК в клетки. Уже в 1991г. «Vical Inc.» приступила к разработке ДНК-вакцин для предупреждения инфекционных заболеваний. Через 2 года в журнале «Science» были опубликованы результаты этих исследований, подтверждающие эффективность применения ДНК-вакцины против гриппа у мышей. Вскоре компания «Vical Inc.» начала разработки производства и продажи терапевтических и профилактических ДНК-вакцин против ВИЧ/СПИДа, туберкулеза, гепатита В, гепатита С, герпеса и заболеваний, вызываемых вирусами папилломы человека. Другой крупнейший производитель вакцин — компания «Aventis Pasteur» — разрабатывает ДНК-вакцины, предупреждающие инфицирование цитомегаловирусом, возбудителем малярии, Н. pylori, респираторно-синцитиальным вирусом, вирусом ветряной оспы и др.

Компания «Vical Inc.» проводит также клинические исследования (I или II фаза) терапевтических вакцин и методов генной терапии (на основе технологии «голой» ДНК) для лечения больных с некоторыми злокачественными новообразованиями. ДНК-вакцины обладают большим потенциалом и могут вызвать революцию в вакцинологии. Однако многие специалисты не спешат делать окончательные выводы до тех пор, пока не получат достаточное количество данных клинических исследований, убедительно свидетельствующих об эффективности и безопасности ДНК-вакцин. В ближайшие несколько лет не следует ожидать их внедрения в медицинскую практику, поскольку большинство из разрабатываемых вакцин находится на этапе доклинических или проходят I—II фазу клинических исследований.

Генотерапия в онкологии. Одновременно с развитием исследований в об­ласти генокоррекции наследственных дефектов успешными также оказались поиски методов тера­певтического использования смысловых последо­вательностей ДНК для лечения ненаследственных заболеваний и, главным образом, злокачественных опухолей и вирусных инфекций. Существенно, что именно в этих разделах патологии поиски путей ге­нокоррекции проводятся особенно интенсивно, а число уже одобренных протоколов клинических ис­пытаний во много раз превышает число таковых для лечения моногенных болезней.

Основные методологичес­кие подходы к генотерапии различных опухолей, вполне приложимы и для борь­бы с наиболее се