Иммуноферментный анализ.

Иммуноферментный анализ, или метод (ИФА) — выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хрена, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченой ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом и изменяется цвет продукта реакции — интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. ИФА применяют для диагностики вирусных, бактериальных и паразитарных болезней, в частности для диагностики ВИЧ-инфекций, гепатита В и др., а также определения гормонов, ферментов, лекарственных препаратов и других биологически активных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях (10¹⁰ — 10¹² г/л.).

Твердофазный ИФА- вариант теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или антигенов. При положительном результате изменяется цвет хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания.

Рис.30. Схема ИФА.

1.При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстрат для фермента.
2. При определении антигена в лунки с сорбированными антителами вносят антиген (напр., сыворотку крови с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыворотку против него и вторичные антитела (против диагностической сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хромоген для фермента.

Рис. 31.Иммуноферментный анализ (схема).

ИММУНОБЛОТТИНГ. Иммуноблоттинг (син. вестернблоттинг) — высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др. Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их (блоттинг - от англ. blot, пятно) из геля на активированную бумагу(1) или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с “блотами” антигенов*. На эти полоски наносят сыворотку больного(2). Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом(3). Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата(4), изменяющего окраску под действием фермента. Рис. 32. Схема иммуноблотинга Примеры Вестерн-блотов при анализе на ВИЧ-инфекцию ( рис.33).

Тестовые задания для самоконтроля.

1.Иммунология как наука изучает:

А - Невосприимчивость организма к инфекционным заболеваниям

Б - Восприимчивость организма к инфекционным заболеваниям

В – Генетические механизмы реагирования на чужеродные субстанции

Г- Генетические, молекулярные и клеточные механизмы реагирования организма на чужеродрные субстанции

2. К факторам неспецифической защиты относятся:

А - Биоценоз кожи и слизистых оболочек, физиологические отправления организма, иммуноглобулины класса «А», лейкоциты и моноциты крови.

Б - Барьерная функция кожи и слизистых оболочек, гуморальные и клеточные факторы, воспалительная реакция.

В – Барьерная функция кожи и слизистых оболочек, гуморальные и клеточные факторы, выделительные системы организма.

Г- Комплимент, интерферон, лизоцим, микрококки, гранулоциты.

Д- Фагоцитоз, биоценоз кожи и слизистых оболочек, комплимент, интерферон.

3. В синтезе белков системы комплемента принимают участие клетки:

А- печени

Б- селезенки

В- эпителия кишечника

Г- макрофаги

Д- все перечисленные

4. Альфа- интерферон синтезируется:

А- гранулоцитами

Б- тромбоцитами

В- лимфоцитами

Г- макрофагами

5. Система комплемента:

А- обеспечивает опсонизацию и лизис чужеродных клеток

Б- стимулирует хемотаксис фагоцитов

В- стимулирует фагоцитоз

Г- участвует в элиминации иммунных комплексов

Д- все перечисленное

6.К клеточным факторам неспецифической защиты относятся:

А- нормальная микрофлора кожи и слизистых, гранулоциты

Б- лимфоциты и макрофаги

В- лейкоциты, макрофаги, «естественные киллеры»

Г- фагоциты, лимфоциты, микрококки

Д- пропердин, С- белок, гранулоциты

7.Антигенностью могут обладать:

А- Белки

Б- полисахариды

В- полипептиды

Г- все перечисленное

8. Гаптены- это:

А- «неполные» антигены

Б- токсины

В- «неполные антитела»

Г- ферменты

Д- высокомолекулярные белки

9. Специфическую защиту организма осуществляют органы и клетки:

А- ретикулоэндотелиальной системы

Б- мочеполовой системы

В- лимфоидной и частично ретикулоэндотелиальной системы

Г- эндокринной системы

Д- сердечно-сосудистой системы

10. Количество лимфоидной ткани в тимусе с возрастом человека:

А- не изменяется

Б- увеличивается незначительно

В- увеличивается значительно

Г – уменьшается значительно

11.Тимозин влияет на созревание:

А-В-лимфоцитов

Б – Т-лимфоцитов

В- макрофагов

Г- эритроцитов

12. Центральным органом Т-системы иммунитета является:

А- лимфатический узел

Б- селезенка

В – костный мозг

Г- вилочковая железа

Д- гипофиз

13. К периферическим органам иммунной системы относятся:

А- регионарные лимфатические узлы, селезенка.

Б – тимус

В- костный мозг

Г- гипофиз

14. Клеткой-родоначальницей всех лимфоцитов является:

А- гранулоцит

Б- Т-лимфоцит

В- моноцит

Г– стволовая клетка

15. Антигенпрезентирующими клетками в основном являются:

А- Т- лимфоциты

Б- В- лимфоциты

В- «ЕК» клетки

Г- макрофаги

Д- гепатоциты

16. Процессирование антигена осуществляют:

А- гепатоциты

Б- лейкоциты

В- макрофаги

Г- лимфоциты

Д- стволовые клетки

17. К клеткам, оказывающим угнетающее действие на иммунологические реакции, относятся:

А- Т- супрессоры

Б- Т-хелперы

В- плазматические клетки

Г- Т- киллеры

Д- В- лимфоциты

18. Антитела синтезируются :

А- В-лимфоцитами

Б- Т-хелперами

В- плазматическим клетками

Г- макрофагами

Д- Т-супрессарами

19. Плазматические клетки являются конечной стадией дифференциации:

А- макрофагов

Б- В-лимфоцитов

В- Т- хелперов

Г- Т- супрессоров

Д- Т- киллеров

20. Место созревания В- лимфоцитов:

А- кровь

Б- вилочковая железа

В- костный мозг

Г- макрофаг

21. Место созревания Т-лимфоцитов:

А- костный мозг

Б- тимус

В- лимфатический узел

Г- кровь

21. Цитофильные антитела, принимающие участие в анафилактической реакции, принадлежат к Ig класса :

А- класса А

Б- класса М

В- класса G

Г- класса Е

22. Какие иммуноглобулины проникают через плаценту и обеспечивают пассивный иммунитет у новорожденного?

А- Ig M

Б - Ig G

В- IgD

Г - Ig E

Д - Ig A

23. За неспецифическую цитотоксичность отвечают:

А- гранулоциты

Б- эозинофилы, базофилы

В- ЕК

Г- Т-хелперы

24. Пропердин- это:

А- неспецифический белок противовирусной защиты организма

Б- белок, принимающий участие в активации комплемента по альтернативному пути

В- фермент, расщепляющий пептидогликан

Г- белок, активирующий комплемент по классическому пути

25.Лимфокины- это:

А- вещества, продуцируемые бактериями

Б- факторы защиты организма

В- медиаторы иммунного ответа

Г- ферменты, расщепляющие пептидогликан

26.Какие клетки в организме осуществляют противоопухолевый надзор?

А- эозинофилы

Б- эритроциты

В- ЕК

Г- дендритные клетки

27. Реакция агглютинации - это реакция, учет которой проводится по образованию:

А- зонтика агглютинированных эритроцитов

Б - агглютината в электролите

В- гемолиза эритроцитов

28. В реакции связывания комплемента (РСК ) комплемент связывается только : А-индикаторными системами

Б- специфическими системами

В-специфической и индикаторной одновременнО

29. Реакция агглютинации, применяемая при серологической идентификации культур проводится:

А- в полистироловых плашках

Б- на стекле

В- в пробирках

30.Учет результатов при иммуноферментном анализе лучше проводить с помощью:

А- люминесцентного микроскопа

Б- нефелометра

В- спектрофотометра (ридера)

31.Установите соответствие: В реакции агглютинации антиген –

А- должен быть растворимым

Б- должен быть корпускулярным

В- вид антигена не имеет значения

32. Установите соответствие: В РСК антиген-

А- должен быть растворимым

Б- должен быть корпускулярным

В- должен диффундировать в гель

Г- вид антигена не имеет значения

33. В реакции агглютинации (РА) положительный результат-

А- образование хлопьев с просветлением суспензии

Б- задержка гемолиза

В- помутнение

Г- гемолиз

Д-."зонтик"

Е- изменение окраски

34.В реакции иммуноферментного анализа (ИФА) положительный результат-

А- образование хлопьев с просветлением суспензии

Б- задержка гемолиза

В- Помутнение

Г- гемолиз

Д-"зонтик"

Е- изменение окраски

35. В РСК положительный результат –

А- образование хлопьев с просветлением суспензии

Б- задержка гемолиза

В- гемолиз

Г- изменение окраски.

36. Для идентификации полиовирусов с помощью реакции нейтрализации ЦПД необходимо иметь:

А- парные сыворотки больного

Б- диагностические сыворотки против полиовирусов

В- диагностикум

Г- эталонные штаммы вирусов полиомиелита

Д- культуру клеток НЕР-2

Е-вирусосодержащий материал в рабочей дозе

Ж- испражнения больного

37. Для серодиагностики полиомиелита с помощью реакции нейтрализации ЦПД необходимо иметь:

А- парные сыворотки больного

Б- диагностическую сыворотку против полиовирусов

В- диагностикум

Г- эталонные штаммы вирусов полиомиелита

Д- культуру клеток НЕР-2

Е- суспензию эритроцитов гуся

38. Уровень напряженности иммунитета к вирусу полиомиелита определяется в реакции:

А- преципитации

Б- связывания комплемента

В- нейтрализации

Г- всех перечисленных

39.Линия преципитации при определении дифтерийного токсина в агаре свидетельствует:

А- об его отсутствии

Б- о наличии токсина в испытуемом штамме

В- о наличии антител к дифтерийному токсину

40.Серологическая идентификация штамма проводиться с целью определения:

А- антигенной структуры штамма

Б- антительной структуры

В- комплекса антиген-антитело

41. Для определения гемолитической активности комплемента необходимо иметь:

А- эритроциты барана и гемолитическую сыворотку

Б- эритроциты человека (0 -группы крови) и гемолитическую сыворотку

В- любые эритроциты и гемолитическую сыворотку

42.Иммуноблотинг - это вариант постановки:

А- реакции иммунолюминесценции

Б- иммуноферментного анализа

В- радиоиммунного анализа

43. Микроскоп необходим для учета результатов следующих серологических реакций, используемых при идентификации вирусов в :

А- РН ЦПД

Б- РСК

В- РТГА

Г- РИФ

Д- Преципитации

Список литературы:

1. Петров Р.В.- Иммунология. М., Медицина. 1987.

2. Иммунология под. ред. У.Пола. М., Медицина, 1991.

3. Ройт. А., Основы иммунологии. М., Медицина, 1992.

4. Борисов Л.Б., Смирнова А.М. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Учебник - М., Медицина, 1994.

5. Коротяев А.И., Бабичев С.А.- Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. Учебник.- СПб: “Специальная литература”, 1998.

7. Вершигора А.Е.- Иммунология. Киев, 1990.

8. Фрималь Х., Борок И., -Основы иммунологии., М., 1986.

.